杨 涛，黎妍妍，郑 露，黄俊斌，魏小慧，郭 利，袁跃斌，王 瑞，李锡宏*，张双祥，龙开勋

（1.华中农业大学植物科技学院，湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室，武汉430070；2.湖北省烟草科学研究院，武汉 430030；3.湖北省烟草公司十堰市公司，湖北 十堰 442000；4.湖北省烟草公司襄阳市公司，湖北 襄阳 441100；5.湖北省烟草公司宜昌市公司，湖北 宜昌 443000；6.湖北省烟草公司恩施州公司，湖北 恩施 445500）

湖北烟区烤烟赤星病病原鉴定

杨 涛1，黎妍妍2，郑 露1，黄俊斌1，魏小慧3，郭 利4，袁跃斌5，王 瑞6，李锡宏2*，张双祥5，龙开勋5

（1.华中农业大学植物科技学院，湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室，武汉430070；2.湖北省烟草科学研究院，武汉 430030；3.湖北省烟草公司十堰市公司，湖北 十堰 442000；4.湖北省烟草公司襄阳市公司，湖北 襄阳 441100；5.湖北省烟草公司宜昌市公司，湖北 宜昌 443000；6.湖北省烟草公司恩施州公司，湖北 恩施 445500）

为研究湖北各烟区烟草赤星病病原菌的种类和地理分布，对湖北烟区的72株烟草赤星病病原菌进行形态学观察，共鉴定出4个种，在此基础上对其中8个典型菌株的rDNA-ITS和Plasma membrane ATPase（ATPase）基因进行测序分析，从分子水平上进一步证实湖北烟区烟草赤星病为链格孢（Alternaria alternata）、长柄链格孢（A. longipes）、细极链格孢（A.tenuissima）和鸭梨链格孢（A. yaliinficiens）侵染所致。其中A. longipes广泛分布于湖北各烟区，是优势种群，占69%；A.tenuissima和A. alternata分布在宜昌、十堰、恩施3个烟区；A. yaliinficiens仅在恩施区域零星分布，约占3%。该试验也证实了ATPase基因可以用来作为烟草赤星病病原的辅助鉴定。

烟草赤星病；链格孢；病原鉴定

烟草赤星病是由链格孢属真菌引起的烟叶生长后期主要的叶部真菌性病害，是世界烟草生产上威胁最大的病害之一[1]。烟草赤星病在我国各烟区均有发生，以黑龙江、山东、河南、安徽、湖南、广西、贵州等省区发生为害较重。一般烟田发病率为5%～10%，重病田可达20%甚至50%以上[2]。湖北省常年种植烟草3万hm2以上，近年来烟草赤星病已经发展为湖北烟区的主要病害之一，且有逐年加重的趋势。

以往研究主要通过种植抗性烟草品种、调整施肥量和移栽期、施用药剂等措施进行烟草赤星病的防治[3]。在病害综合治理过程中，对致病菌进行病原鉴定是病害防治的前提和基础。目前已知引起烟草赤星病的链格孢种类有 Alternaria alternata、A.longipes、A. tenuissim、A. yaliinficiens和河南省发现的一个新种A. tabacicola[4]，国内鉴定烟草赤星病病原菌主要采用产孢表型、分生孢子等形态学指标[5-6]，在分子鉴定方面主要采用rDNA-ITS、Gpd、OPA2-1、ACT等基因进行分子辅助鉴定，这些基因被证实在已经发现的烟草赤星病病原菌种间的差异不显著[4]，而国外采用的Plasma membrane ATPase基因被证实在链格孢种间差异明显[7]，可以用作对烟草赤星病的鉴定。本试验采用单孢分离方法对病原菌进行了分离、培养、纯化和致病力测定，参照目前链格孢种鉴定采用的形态指标[8]，结合多基因位点序列[7]，对湖北省烟草赤星病病原菌进行了系统发育分析，旨在探明湖北省内各烟区烟草赤星病菌的种类和分布情况，为烟草赤星病的科学防治和抗病育种工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 烟草赤星病病样采集

2016年6—10 月从湖北省十堰、襄阳、宜昌、恩施4个市（州）烟草主要种植区采集烟草赤星病典型病叶，用于分离病原菌。

1.2 实验试剂和仪器

实验试剂：PDA培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15 g，蒸馏水定容至1000 mL）；PCA培养基（马铃薯20 g，胡萝卜20 g，琼脂粉15 g，蒸馏水定容至1000 mL）。实验仪器：PCR仪器、显微成像系统、打孔器（6 mm）。

1.3 病原菌分离和保存

采用单孢分离法分离烟草赤星病菌。病叶用沾有75%酒精的清洁布擦拭一遍，再用蒸馏水清洗后，置于28 ℃、光暗交替（12 h/12 h）的恒温培养箱中保湿培养。3 d后将产孢后的病斑放在2%水琼脂平板上轻轻按压，将平板倒扣置于显微镜下用毛细管针挑取单个分生孢子置于水琼脂平板，待长出单菌落后保存于滤纸片上，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.4 致病性测定

采用漂浮育苗方法播种云烟87，用于病原菌致病性测定。将单孢分离菌株转至 PDA培养基上，置于22 ℃、光暗交替的恒温培养箱中培养。7 d后在菌落边缘打取直径为6 mm的菌丝块，接种保湿放置在育苗盘上 7～10叶期的健康烟草叶片上，在25 ℃、光暗交替（12 h/12 h）的恒温培养箱中培养3 d后观察发病情况，发病后，从病斑上再次分离病原物，检测是否与接种菌株相同。试验重复3次。

1.5 孢子形态和产孢表型观察

单孢菌株接种到PCA平板上置于22 ℃、光暗交替（12 h/12 h）的恒温培养箱中培养5 d后，在无菌条件下用灭菌的棉签刮掉 PCA平板上面的菌丝，置相同培养条件培养 2～5 d，在显微镜下观察产孢表型及分生孢子形态和大小，采用SIMMONS[7]关于链格孢属的标准鉴定方法进行鉴定。

1.6 烟草赤星病的分子鉴定、PCR扩增和序列测定

单孢菌株在PDA平板上培养5～7 d后，用无菌牙签挑取少量菌丝，置于1.5 mL离心管中，加入50 μL 10×TE buffer，用微波炉法提取总 DNA[9]，吸取10 μL上清液作为PCR模板。对其核糖体转录间隔区（rDNA-ITS）、质膜ATP酶（Plasma membrane ATPase）基因片段进行 PCR扩增，所用引物分别为 ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGC）和 ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）、ATPDF1（ATCGTCTCCATGACCGAGTTCG）和ATPDR1[7]（TCCGATGGAGTTCATGATAGCC），反应体系均为50 μL。扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测后，对已扩增好的产物委托武汉金开瑞生物技术有限公司进行序列测定。

1.7 序列分析及系统发育树构建

将供试8个菌株（YC-WF-750-2、YC-CY-1200-2、SY-ZX-1250-1、ES-LC-1410-5、SY-ZX-1250-2、ES-XF-815-1、ES-BD-1100-1、XY-BK-800-2）测序序列运用DNAStar进行双向拼接并进行人工校对，得到可信序列。将供试菌株所得序列置于GenBank中进行Blast比对，并从GenBank中下载相关标准菌株序列（表1），将下载的标准菌株序列和测序结果进行多序列比对，并对两个基因序列进行连接合并，A. infectoria设为组外对照，序列比对和连接结果在MEGA7.0 中采用邻近法（Neighbor Joining，NJ）构建系统发育树（自检1000次）。

表1 构建系统发育树所用菌株的种类及GenBank登录号Table 1 Species for the construction of phylogenetic trees for phylogenetic trees, and GenBank accession number

2 结 果

2.1 湖北省烟草赤星病病原菌菌株分离和致病性测定

对分离培养纯化的 72株烟草赤星病菌株进行了致病性测定，发现所有菌株均可引起健康烟草叶片发病（图1C-D），对照组未见发病。

2.2 烟草赤星病菌的形态学鉴定

图1 烟草赤星病田间发病症状(A)、成熟叶片局部症状(B)、菌株XY-BK-800-2(C)和SY-FX-700-1(D)致病性检测症状Fig. 1 The symptoms of tobacco brown spot in field (A), the local symptoms of mature leaves (B), the pathogenicity of the strains XY-BK-800-2(C) and SY-FX-700-1 (D)

表2 4种链格孢在PDA培养基上观察到的菌落形态特征Table 2 Colorectal characteristics of the four Alternaria species on PDA medium

表3 4种链格孢在PCA培养基上观察到的形态特征Table 3 Morphological characteristics of the four Alternaria species on PCA medium

表4 湖北省烟草赤星病病原菌形态学鉴定结果Table 4 Morphological identification of tobacco brown spot in Hubei Province

以SIMMONS[8]、张天宇[10]的分类标准为依据，同时参照祖艳青[4]和严进[14]对鸭梨链格孢的鉴定，通过观察菌株的菌落形态（表2）、产孢表型和分生孢子梗形状以及分生孢子形状、大小、隔膜等特征（表3），对72株烟草赤星病病原菌的菌株进行了形态学鉴定（表4）。湖北省烟草赤星病病原菌鉴定为4个种，分别是Alternaria alternata、A. longipes 、A. tenuissima和A. yaliinficiens。各链格孢种在菌落、产孢链、分生孢子等方面呈现不同的形态。其中Alternaria longipes（图2 A、E、J）和A. tenuissima（图2 D、H、M）产孢链都是直链，少有分支；但A. longipes在PDA培养基上菌落生长速度缓慢，孢子多倒棍棒状，少数椭圆形和卵圆形，大部分孢子顶端常延伸，形成长至40～70 μm的次生分生孢子梗（假喙），假喙向孢身过度处孢壁变薄，至上部颜色变淡；A. tenuissima成熟分生孢子孢身中部常有一颜色加深的横隔膜，且缩隘更明显。A. alternata（图2B、F、K）和A. yaliinficiens（图2 C、G、L）产孢链都有大量分支；但A. alternata形成的产孢链多矮树状，主链和支链孢子数量相差不大；A.yaliinficiens主链孢子数明显多于支链孢子数，且孢子多是卵形或椭圆形。

图2 A. longipes的菌落形态(A)、产孢表型(E)和孢子形态(J)；A. alternata的菌落形态(B)、产孢表型(F)和孢子形态(K)；A. yaliinficiens的菌落形态(C)、产孢表型(G)和孢子形态(L)；A tenuissima的菌落形态(D)、产孢表型(H)和孢子形态(M)，标尺：E-M=50 μmFig. 2 Colony morphology (A), sporulation phenotype (E) and spore morphology (J) of A. longipes; colony morphology (B),sporulation phenotype (F) and spore morphology (K) of A. alternata; colony morphology (C), sporulation phenotype (G) and spore morphology (L) of A. yaliinficiens; colony morphology(D), sporulation phenotype (H) and spore morphology (M) of A tenuissima,scale: E-M=50 μm

2.3 4种链格孢致病菌在湖北的地理分布

根据病原菌的形态学鉴定，在所有鉴定的菌株中，Alternaria longipes是优势种，经鉴定有50株，占所有菌株的69%（图3），在湖北4个烟区以及各海拔高度均有分布。A. alternata有12株，占17%；A. tenuissima有8株，占11%；两个小种在宜昌、十堰、恩施 3个烟区的各海拔烟田都有分布。A.yaliinficiens经鉴定有2株，所占比例为3%，仅分布于恩施烟区。

2.4 4种链格孢多基因位点序列分析

图3 各小种所占数量比例Fig. 3 The proportion of the number of each species

为了进一步证实形态学鉴定结果的准确性，从每个链格孢种挑选出2个代表菌株共8个菌株进行了rDNA-ITS和Plasma membrane ATPase基因扩增测序，分别获得了532～544 bp和1143～1265 bp大小的序列。基于rDNA-ITS、ATPase基因序列构建的NJ（Neighbor Joining）系统发育树表明（图4），形态学鉴定为A. alternata的菌株YC-WF-750-2、YC-CY-1200-2与标准菌株EGS 34-016（A. alternata）聚在一个分支；形态学上鉴定为A. longipes的菌株SY-ZX-1250-1、XY-BK-800-2与标准菌株 EGS 30-033（A. longipes）聚在一个分支；形态学上鉴定为 A. tenuissima的菌株 ES-LC-1410-5、SY-ZX-1250-2和标准菌株X1309（A. tenuissima）聚在一个分支；形态学鉴定为A. yaliinficiens的菌株ES-XF-815-1、ES-BD-1100-1单独聚在一个分支。

图4 基于rDNA-ITS，ATPase基因序列构建的NJ（Neighbor Joining）系统发育树Fig. 4 The NJ (Neighbor Joining) phylogenetic tree constructed based on rDNA-ITS and ATPase gene sequence

3 讨 论

本研究通过形态学鉴定和rDNA-ITS及Plasma membrane ATPase测定及分析，证实引起湖北烟区烟草赤星病病原菌的组成为 Alternaria tenuissima、Alternaria. alternata、Alternaria. longipes、Alternaria.Yaliinficiens 4个链格孢种；其中A. longipes是优势种，占总数的69%。据报道这4种链格孢菌能广泛引起全国各个烟叶种植区烟草赤星病害，其中 A.alternata和A. longipes可引起贵州烟草赤星病[5]，A. tenuissima可引起重庆烟草赤星病[6]等。而河南省分离到的烟草赤星病病原菌除这4个种外，还有一个新种 A. tabacicola[4]。研究表明，烟草上的这 4种链格孢病原菌也能引起其他农林作物减产，A.tenuissima能引起玉米叶枯病[12]，A. alternata、A.tenuissima不仅能引起核桃发病[13]，还能引起鸭梨贮藏期发病[14]等。本研究利用形态学和分子生物学手段对链格孢致病菌种类进行了准确鉴定，为病原菌的变异和病害流行规律理论和基础。

4个种在湖北烟区的各区域分布略有差异。恩施烟区种类组成复杂，4个种都有；宜昌和十堰烟区分离的菌株包含了A. alternata、A. longipes、A.tenuissima 3个种；襄阳烟区仅分离到 A. longipes一个种。据万科等[15]对贵州、关博元等[16]对重庆烟草赤星病的研究结果表明，不同区域分离得到的烟草赤星病菌以及不同种的赤星病菌对健康烟叶的致病力存在明显差异。

在形态学上，SIMMONS[8]将产孢表型用于链格孢的种级分类，认为在孢子形态相似的情况下，产孢表型的差别更为丰富和明显。一般认为分生孢子的形状、大小、分隔状况、孢子表面的纹饰特点、分生孢子的着生方式、喙的有无和形态，是链格孢种的主要分类标准[17]。菌丝特征、菌落特点、分生孢子梗的形态、寄主范围等是种级分类的辅助依据。不论是主要依据还是辅助依据，都有一定程度的变幅，要准确鉴定链格孢的种，必须在依据主要标准的同时，综合考虑其他标准。

在分子水平上，已经报道的引起烟草赤星病的5种链格孢菌在rDNA-ITS区域序列差异不明显，说明它们在遗传上是很接近的自然群体。这与胡中会[18]、祖艳青等[4]报道的结果一致，因此rDNA-ITS区域不适合用于引起烟草赤星病病原的分子鉴定。近年国外研究链格孢分类鉴定广泛采用的 Plasma membraneATPase基因[19]，本研究中也证实该基因在链格孢种间的序列差异明显，可以作为烟草赤星病不同种的辅助鉴定。

4 结 论

本研究通过对湖北烟区烟草赤星病病原菌进行形态学观察及典型菌株的 rDNA-ITS和 Plasma membrane ATPase基因测序分析，明确了湖北烟区烟草赤星病的病原菌种类及其分布，并证实了Plasma membrane ATPase基因可以用来作为烟草赤星病的病原鉴定。引起湖北烟区烟草赤星病的链格孢种有 Alternaria tenuissima、A. alternata、A.longipes、A. yaliinficiens；其中A. longipes是引起湖北烟区烟草赤星病的优势种，在湖北省各个烟区均有发现；A. alternata和A. tenuissima分布在宜昌、十堰、恩施3个烟区；而A. yaliinficiens只在恩施烟区有少量的发现。

[1] 华劲松，王强. 烟草赤星病发生程度对烟叶产量及产值损失估测[J]. 技术与市场，2014（2）：129-130.

[2] 曹立耘. 烟草赤星病的发生与综合防治[J]. 乡村科技，2015（15）：20-20.

[3] 范敬修，饶勇，祝庄品，等. 烟草赤星病发病规律及防治技术研究[J]. 安徽农业科学，2014，42（14）：4240-4241.

[4] 祖艳青，蒋士君，王海涛，等. 河南省烟草赤星病病原鉴定[J]. 中国烟草学报，2013，19（4）：73-77.

[5] 唐承成，曾琛，姜于兰，等. 贵州省烟草赤星病病原菌的鉴定[J]. 湖北农业科学，2015，54（15）：3656-3658.

[6] 耿莉娜，帅红，赵敏，等. 重庆巫溪烟区烟草赤星病病原鉴定[J]. 江苏农业科学，2016，44（8）：181-183.

[7] ZHU X Q, XIAO C L. Phylogenetic, morphological, and pathogenic characterization of Alternaria species associated with fruit rot of blueberry in California [J].Phytopathology, 2015, 105 (12): 1555.

[8] SIMMONS E G. Alternaria: An Identification Manual[M]. Utrecht: CBS fungal biodiversity centre, 2007:1-585.

[9] 潘力，崔翠，王斌. 一种用于PCR扩增的丝状真菌DNA快速提取方法[J]. 微生物学通报，2010，37（3）：450-453.

[10] 张天宇. 中国真菌志：链格孢属[M]. 北京：科学出版社，2003：1-220.

[11] ROBERTS R G. Alternaria yaliinficiens sp. nov. on Ya Li pear fruit: From interception to identification[J]. Plant Dis. 2005, 89: 134-145.

[12] 翟凤艳，张柯，刘英杰，等. 新乡地区枝孢菌病害病原鉴定[J]. 河南科技学院学报（自然科学版），2015，43（4）：30-35.

[13] 曲文文，刘霞，杨克强，等. 山东省危害核桃的链格孢属真菌鉴定及其系统发育[J]. 植物保护学报，2012，39（2）：121-128.

[14] 严进，施宗伟，宋福，等. 河北和山东鸭梨果实上链格孢菌鉴定[J]. 植物保护学报，2009，36（1）：37-43.

[15] 万科. 烟草赤星病致病力分化及拮抗菌拮抗机制初步探究[D]. 贵阳：贵州大学，2015.

[16] 关博元，肖崇刚，陈国康，等. 重庆市烟草赤星病菌致病力测定[J]. 植物保护，2007，33（3）：62-64.

[17] WOUDENBERG J H C, GROENEWALD J Z, BINDER M, et al. Alternaria redefined[J]. Studies in mycology,2013, 75(1): 171-212.

[18] 胡中会，赵立华，严恩平. 云南烟草赤星病菌及近似种rDNA-ITS序列分析[J]. 云南农业大学学报，2012，27（5）：670-676.

[19] LAWRENCE D P, GANNIBAL P B, DUGAN F M, et al.Characterization of Alternaria isolates from the infectoria species-group and a new taxon from Arrhenatherum,Pseudoalternaria arrhenatheria sp. Nov [J]. Mycol progress, 2014, 13: 257-276.

Identification of Pathogens Causing Flue-cured Tobacco Brown Spot in Hubei Province

YANG Tao1, LI Yanyan2, ZHENG Lu1, HUANG Junbin1, WEI Xiaohui3, GUO Li4,YUAN Yuebin5, WANG Rui6, LI Xihong2*, ZHANG Shuangxiang5, LONG Kaixun5
(1. College of Plant Science & Technology of Huazhong Agricultural University, The Key Lab of Plant Pathology of Hubei Province,Wuhan 430070, China; 2. Tobacco Research Institute of Hubei Province, Wuhan 430030, China; 3. Shiyan Tobacco Company of Hubei Province, Shiyan, Hubei 442000, China; 4. Xiangyang Tobacco Company of Hubei Province, Xiangyang, Hubei 441100,China; 5. Yichang Tobacco Company of Hubei Province, Yichang, Hubei 443000, China; 6. Enshi Tobacco Company of Hubei Province, Enshi, Hubei 445500, China)

In order to study the species and geographical distribution of tobacco brown spot disease in tobacco fields of Hubei Province, seventy two isolates causing tobacco brown spot in Hubei Province were identified based on morphology and eight typical isolates were analyzed based on sequences of rDNA-ITS and ATPase. The results showed that the pathogens causing tobacco brown spot in Hubei tobacco areas were identified as Alternaria alternata, A. longipes, A. tenuissima and A. yaliinficiens. Among them, A.longipesis was the dominant species distributed in all tobacco-growing areas in Hubei with a high occurrence of 69%. A. tenuissima and A. alternata were found in three areas of Yichang, Shiyan and Enshi. A. yaliinficiens was only isolated in Enshi. In addition, the results also indicated that ATPase gene sequence comparison could be a useful way to differentiate the four pathogensof tobacco brown spot.

tobacco brown spot; alternaria; pathogen identification

S435.72

1007-5119（2017）05-0032-07 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2017.05.006

湖北省烟草专卖局重点项目“湖北省烟草赤星病生物防治技术研究与应用”（027Y2015-005）

杨 涛（1992-），男，在读硕士，专业方向：植物真菌病害。E-mail：1358088452@qq.com。*通信作者，E-mail：lxh885@126.com

2017-07-25

2017-10-05