纪 元，胡利伟，蔡宪杰，许成悦，范子彦，师默闻，唐纲岭，邓惠敏*，闫 鼎*

1.国家烟草质量监督检验中心，郑州高新技术产业开发区翠竹街6号 450001

2.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001

3.上海烟草集团有限责任公司，上海市长阳路717号 200082

长柄链格孢菌（Alternaria longipes）是链格孢属（Alternaria）真菌，也是引起烟草赤星病的主要病原菌［1］。多个国家曾报道过烟草赤星病的爆发，在我国各烟区也均有赤星病的发生，造成了较大的经济损失［2-4］。目前赤星病主要通过捕捉田间赤星病原孢子来预警，该方法需要相应的设备，准确性较低，检测用时较长，赤星病一旦发生则很难控制。因此，建立一种经济、准确和快速的烟草赤星病检测方法，在疾病发生早期检测烟草幼苗或叶片中的链格孢菌，对赤星病的绿色防控尤为重要。

检测链格孢菌的传统方法包括形态学法［5-6］、化学分析法［7-8］、分子检测法［9-10］和免疫检测法［11-12］等。其中形态学法采用微生物培养手段，要求微生物必须是可培养的，耗时长且对操作者的专业性要求高。化学分析法是对微生物特定成分进行检测，无需对微生物进行培养，虽灵敏度高，但由于该方法的检测仪器不便携带，不适用于现场快速检测。而胶体金免疫层析技术结合抗原抗体特异性识别和微流层析技术，具有操作简单、检测速度快、不受检测设备和试剂限制等优点，已广泛应用于食品和医疗等行业［13-15］。Huang等［16］研制的胶体金免疫层析试纸条成功应用于水稻条纹病毒的快速检测，该检测准确性高，特异性好。此外，多个公司制备了检测血清中抗新型冠状病毒IgG/IgM抗体的胶体金试纸条，与ELISA结果比较具有一致的特异性和准确性，不仅适用于家庭检测，也适用于医院的即时检验（Point-of-care testing）［17］。然而，目前还未见针对链格孢菌的胶体金快速检测试纸条的文献报道和商品化的快速检验试剂盒。

为此，通过将小鼠抗长柄链格孢菌单克隆抗体进行胶体金标记，研制能够灵敏且特异性地检测长柄链格孢菌的胶体金试纸条，旨在实现烟叶生产中赤星病的快速检测和识别，为赤星病的有效防控提供准确、及时的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

主要试剂耗材：牛血清白蛋白（BSA）、柠檬酸三钠、氯金酸、吐温80、生物素（美国Sigma-Aldrich公司）。Amicon®亲和浓度试剂盒蛋白A（美国Merck Millipore公司）。硝酸纤维素膜（德国Sartouris公司）。吸水滤纸、玻璃纤维纸、聚酯纤维纸和PVC板（上海捷宁生物科技有限公司）。

菌株：长柄链格孢菌分离自昆明禄劝，由云南省烟草农业科学院提供。菌落被接种在含10%（体积分数）新鲜烟叶提取物的马铃薯葡萄糖（PDA）培养基上，26°C培养7 d。大肠杆菌（Escherichia coli）、根黑腐串珠霉菌（Thielaviopsis basicola）、烟草黑胫病菌（Phytophthora nicotianae）和疣孢青霉菌（Penicillium verruculosum）来自郑州烟草研究院生态环境与烟叶质量重点实验室。黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus）和马铃薯Y病毒（Potato virus Y）阳性对照购自美国Agdia公司。

主要仪器：Megafuge 8R离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司），划膜喷金标机HGS510和切条机HGS201（杭州峰航科技有限公司），双稳定时电泳仪PAC3000（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 长柄链格孢菌抗原的制备

将长柄链格孢菌菌丝超声处理15 min，离心后将沉淀进行液氮研磨，再次超声处理后，13 700×g离心10 min，将上清液超滤浓缩，得链格孢菌蛋白1。

将长柄链格孢菌菌丝进行液氮研磨，取1 g粉末溶于NS2T裂解液，置于冰上超声10 min。1L NS2T裂解液的配方为0.1 mol Tris-HCl、0.1 mol NaCl、0.5 mol蔗糖、0.01 mol EDTA、2.4 mmol脱氧胆酸钠、3 g Triton X-100、4.9 mmol 3-［3-（胆酰胺丙基）二甲基铵］-1-丙磺酸内盐（CHAPS）、0.01 mol 3-（环己氨基）2-羟基-1-丙磺酸（CAPSO）、1 mmol蛋白酶抑制剂鸡尾酒、2 mmol苯甲基磺酰氟（PMSF）、10 mmol二硫苏糖醇（DTT）。裂解物13 700×g转速离心10 min，取上清得链格孢菌蛋白2。将蛋白裂解液与上样缓冲液混合后进行SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染胶。

将2 g长柄链格孢菌菌丝液氮研磨，加入4 mL磷酸盐缓冲液（PBS）后超声处理15 min，13 700×g转速下离心10 min获得链格孢菌蛋白3。

1.2.2 单克隆抗体的制备和纯化

50μg长柄链格孢菌菌丝裂解液与弗氏完全佐剂充分乳化后分别皮下注射2只6~8周龄的BALB/c雌鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司），之后菌丝裂解液与弗氏不完全佐剂混合并免疫小鼠3次，每次间隔为2周。最后一次免疫完成1周后，取小鼠血清采用间接竞争ELISA法进行效价检测［18］。细胞融合3 d前，将50μg菌丝裂解液与PBS混合，对小鼠进行免疫冲击。将小鼠胰脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以10∶1混合，接种在96孔板中［19］。以长柄链格孢菌裂解蛋白为抗原，采用间接竞争ELISA和蛋白质电泳法筛选杂交瘤细胞株［20］，选取高滴度的细胞株进行2次亚克隆。采用体内诱生法制备腹水，向BALB/c小鼠腹腔注入灭菌液状石蜡（0.5 mL/只），7 d后将约5×105个杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔中。根据制造商提供的使用说明，利用蛋白A亲和层析柱进行抗体纯化。纯化后的抗体通过间接竞争ELISA和蛋白质电泳法对其特异性进行验证。

1.2.3 胶体金检测试纸条的制备

1.2.3.1 胶体金标记单克隆抗体

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金。将100 mL 0.3 mmol/L氯金酸溶液加热至沸腾，边搅拌边加入柠檬酸三钠溶液0.04 mol/L）至溶液呈透亮的酒红色，用碳酸钾溶液将pH调整为7.2。按每毫升胶体金溶液加入6~16μg单克隆抗体，加BSA至终浓度为1%（质量分数）。以13 700×g转速4°C离心40 min，将沉淀用复溶缓冲液［含0.2%BSA、0.1%（体积分数）吐温80的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.2］重悬，4°C保存备用。

1.2.3.2 结合物释放垫制备

将玻璃纤维释放垫浸润于Tris缓冲液（pH 7.4）中，37°C干燥。使用喷膜仪将标有胶体金的长柄链格孢菌单克隆抗体和IgY喷涂在结合物释放垫上，37°C干燥后取出备用。

1.2.3.3 反应膜制备

将长柄链格孢菌单克隆抗体捕获抗体包被到反应膜上形成检测线（T），将山羊抗鸡抗体包被在反应膜上构成质控线（C）。

1.2.3.4 试纸条组装

在PVC底板上依次粘贴样品吸收垫、喷涂有标记长柄链格孢菌抗体的胶体金和IgY的结合垫、喷涂有长柄链格孢菌抗体和山羊抗鸡二抗的反应膜、吸水垫，切成3.5 mm的宽度的试纸条后装入卡壳，试纸条结构如图1所示。

图1 长柄链格孢菌检测试纸条结构示意图Fig.1 Schematic illustration of test strips for the detection of A.longipes

1.2.4 测试方法与检测结果的判断标准

称取约0.3 g样品至1.5 mL离心管中，加入1 mL PBST（含10 mmol/L PBS，1%吐温20，0.6 mol/L NaCl），摇晃后静置5 min。取上清液0.1 mL至点样孔中，等待10 min后观察结果。

判断标准：如图2所示，C线显色，T线不显色，表示样品中长柄链格孢菌数量低于检测限，即为阴性。C线和T线均显色，表示样品中长柄链格孢菌数量等于或高于检测限，即为阳性。C线不显色，表示操作不正确或试纸条已失效。

图2 快速检测试纸条判断标准Fig.2 Criteria for rapid detection by test strips

2 结果与分析

2.1 单克隆抗体制备和评价

如图3所示，长柄链格孢菌菌丝裂解液经SDS-PAGE分离，主要条带出现在120、70、38 kDa附近。裂解液与弗氏完全佐剂乳化后免疫小鼠制备单克隆抗体。

图3 长柄链格孢菌蛋白裂解液SDS-PAGE结果Fig.3 SDS-PAGE analysis of A.longipes protein lysates

使用长柄链格孢菌菌丝裂解液免疫BALB/c小鼠，对小鼠血清中的抗体滴度进行检测。如图4a所示，与对照相比，小鼠1和2的血清在450 nm处吸光度明显高于空白小鼠，说明长柄链格孢菌菌丝裂解液作为免疫原诱导抗体效价较高。因此，选取长柄链格孢菌菌丝裂解液免疫的小鼠进行单克隆抗体制备，并用蛋白质电泳对腹水纯化的抗体进行检测。如图4b所示，仅在25 kDa和50 kDa有2个条带，分别对应IgG的轻链和重链，说明抗体已经被制备并纯化。利用ELISA对抗体效价进行评价，包被原为链格孢菌蛋白1、2、3，除了蛋白3，抗体对蛋白1和2响应良好（图4c）。

图4 单克隆抗体的评价Fig.4 Evaluation of the monoclonal antibody

2.2 条件优化

为确定结合垫喷金量，按每厘米结合垫喷涂1.5、2.0、2.5μL金标抗体的喷金量分别将链格孢菌蛋白2稀释1×103倍和1×105倍，检测结果见图5。喷金量为1.5或2.0μL/cm时试纸条可识别链格孢菌，且喷金量为2.0μL/cm时信号更强；当喷金量为2.5 μL/cm时C线有非特异性吸附。因此，选择喷金量为2.0μL/cm。

图5 结合垫喷金量优化Fig.5 Optimisation of the amount of colloidal gold-labelled antibody on the conjugate pad

2.3 灵敏度和特异性评价以及加标样品中的应用

将蛋白浓度为0.2 mg/mL的长柄链格孢菌裂解液进行梯度稀释（图6a）。空白对照呈阴性，当病菌裂解液稀释10倍至1×104倍时，均可检出；当稀释至1×105倍时，试纸条无检出，即检出限为20 ng/mL。但样品稀释10倍时，T线信号较弱，说明可能由于上样浓度过高造成了钩状效应，在实际检测中可能导致假阴性结果。

如图6b所示，将培养平板上其他微生物菌落混悬在1 mL长柄链格孢菌裂解液中，或将病毒的阳性对照用裂解液稀释10倍，用胶体金试纸条进行检测，除长柄链格孢菌外，其他试纸条均呈阴性，说明胶体金试纸条与其余7种微生物无交叉反应，具有较高的特异性。

在没有赤星病感染的云烟85烟叶上分别添加无菌PBS和长柄链格孢菌，取0.5 g撕碎的烟叶分别置于2个离心管中，加入1 mL云烟85烟叶的提取液后混合均匀，取100μL混合后的液体进行检测。如图6c所示，10 min后空白对照T线无信号，然而加标烟叶有检出，说明试纸条受实际样品中基质的干扰较小。

图6 快速检测试纸条的灵敏度（a）和特异性（b）评价以及在加标样品中的检测（c）Fig.6 Sensitivity(a)and specificity(b)of test strips and the detection of a spiked sample by test strips(c)

2.4 稳定性评价

将胶体金试纸条密封装在有干燥剂的铝箔袋中，在37℃下储存6个月进行加速老化测试。根据阿伦尼乌斯方程，加速老化测试可评估长期储存对其性能的影响，试纸条在37℃下保存91 d可视为25℃条件下保存1年［21］。检测阴性对照和稀释100倍的长柄链格孢菌裂解液，每个时间点3次重复。如表1所示，37℃条件下加速老化0至6个月期间，结果无假阳性或假阴性，说明试纸条具有良好的稳定性。

表1 37℃储存条件下快速检测试纸条检测结果Tab.1 Detection results of tests strips stored at 37℃

2.5 讨论

赤星病的病原较多，分类较复杂，有研究鉴定出河南烟区的烟草赤星病病原菌主要是链格孢（A.alternata）、长柄链格孢（A.longipes）、鸭梨链格孢（A.yalinnficiens）［22］；湖北烟区烟草赤星病病原菌主要为链格孢、长柄链格孢、细极链格孢（A.tenuissima）和鸭梨链格孢［23］；重庆烟区烟草赤星病病原菌主要为细极链格孢［24］；贵州烟区发生的烟草赤星病病原菌主要为链格孢菌和长柄链格孢菌［25］。而本试验中所选择的病菌样本仅来自云南省部分烟区，试验材料尚不丰富，对其18S rRNA测序显示分离的菌株为长柄链格孢菌［26］，因此试纸条适用于检测烟叶中病原菌为长柄链格孢菌引起的赤星病，下一步将通过研制复合链格孢菌的检测试纸条，扩大试纸条的检测范围和准确度。此外，胶体金快速检测试纸条目前只对烟叶中的长柄链格孢菌进行了试验，根据理论，本检测方法同样适用于土壤、烟草幼苗、烟草植株其他部分中长柄链格孢菌的定性检测，但仍需进一步试验验证。

3 结论

利用裂解的长柄链格孢菌菌丝作为免疫原，诱导小鼠制备识别长柄链格孢菌的单克隆抗体，并对单克隆抗体进行胶体金微粒标记，构建了一种适用于现场快速检测烟草中长柄链格孢菌的免疫层析试纸条。该快速检测试纸条的检出限为20 ng/mL，且特异性较高，不与烟草上常见的几种真菌、病毒等病原体发生交叉反应。该试纸条具有操作快捷、无需特殊设备和专业技能等优势。