晋佳路 朱仁书 谢育媛 刘红春

458030河南，鹤壁职业技术学院医学院检验系（晋佳路、朱仁书）；湖北省食品药品监督检验研究院生物制品检定所（谢育媛）；郑州大学第一附属医院检验科（刘红春）

CDK2基因沉默联合达卡巴嗪对B16⁃F1黑素瘤的生长抑制作用

晋佳路 朱仁书 谢育媛 刘红春

458030河南，鹤壁职业技术学院医学院检验系（晋佳路、朱仁书）；湖北省食品药品监督检验研究院生物制品检定所（谢育媛）；郑州大学第一附属医院检验科（刘红春）

目的探讨CDK2基因沉默后对达卡巴嗪（DTIC）治疗B16⁃F1黑素瘤抑瘤效应的影响。方法实验设对照组、CDK2⁃shRNA组、DTIC组、CDK2⁃shRNA+DTIC组，MTT法检测各组细胞生长抑制情况，计算药物相互作用指数（CDI值），AnnexinV⁃FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况。建立C57 BL/6小鼠B16⁃F1细胞移植瘤模型，分组实验，持续观察18 d，绘制肿瘤生长曲线，计算肿瘤生长抑制率，TUNEL检测肿瘤组织细胞凋亡情况。结果与对照组相比，CDK2⁃shRNA组、DTIC组、CDK2⁃shRNA+DTIC组在72h的细胞相对存活率分别为（40.6±2.8）%、（45.2±3.7）%、（28.7±2.1）%，细胞凋亡率分别为（25.1±3.3）%、（15.6±2.2）%和（45.6±3.5）%，细胞相对存活率显著降低（F=458.04，P＜0.05）而细胞凋亡率显著升高（F=115.46，P＜0.05），其中CDK2⁃shRNA+DTIC组比DTIC组的细胞相对存活率显著降低（P＜0.01），而细胞凋亡率显著升高（P＜0.01）；两药相互作用指数（CDI值）＜0.7。治疗第6天，对照组、CDK2⁃shRNA组、DTIC组及CDK2⁃shRNA+DTIC组的肿瘤体积分别为（185.44±68.97）mm3、（83.91 ± 14.33）mm3、（123.70 ± 20.85）mm3、（34.54 ± 10.72）mm3。从治疗的第6天开始，与对照组相比，CDK2⁃shRNA组、DTIC组及CDK2⁃shRNA+DTIC组的肿瘤生长速度明显降低（F=11.819，P＜ 0.05），而CDK2⁃shRNA+DTIC组的肿瘤生长速度明显低于DTIC组（P=0.04）；与对照组相比，CDK2⁃shRNA组、DTIC组、CDK2⁃shRNA+DTIC组的肿瘤生长抑制率分别为52.2%、41.2%、86.4%，组织细胞凋亡指数分别为（32.93±3.72）%、（21.62±3.54）%、（63.29±4.74）%，组织细胞凋亡指数显著升高（F=222.25，P＜0.05），其中CDK2⁃shRNA+DTIC组的组织细胞凋亡指数显著高于DTIC组（P＜0.01）。结论沉默CDK2基因的表达可以增加DTIC对黑素瘤的生长抑制作用，二者体外有协同效应，通过增加肿瘤细胞的凋亡是其机制之一。

黑色素瘤；达卡巴嗪；细胞周期蛋白依赖激酶2；基因沉默；细胞凋亡

恶性黑素瘤发生隐匿，在世界范围内发病率和致死性在持续升高［1⁃2］。治疗恶性黑素瘤主要方式是手术切除和放疗，一旦发生转移，各种化疗疗效不理想，预后差［3⁃5］。达卡巴嗪（dacarbazine，DTIC）是第一个由美国食品药品监督管理局（FDA）批准的治疗恶性黑素瘤的药物，至今仍作为评价其他药物对黑素瘤疗效的标准［6⁃8］。然而临床随机对照试验研究显示DTIC单药的有效率仅为6%～12%，中位生存5 ～ 6个月［6⁃8］。其他化疗药物及联合化疗方案与DTIC相比，在临床Ⅲ期试验中并没有表现出明显优势［6⁃9］。因此，有必要针对黑素瘤的特点寻找新的治疗方案。CDK2是周期素依赖性蛋白激酶（cyclin dependent kinase，CDK）家族的重要成员，对细胞分裂周期起关键作用［10⁃11］。研究发现，黑素瘤中CDK2的表达非常活跃［12］，且黑素瘤过于依赖CDK2蛋白，而正常的细胞则不太需要这种蛋白［13］，因此下调CDK2基因表达水平有可能阻止或延缓细胞分裂增殖，达到抗肿瘤的目的。我们前期［14⁃16］针对小鼠黑素瘤构建了重组慢病毒pUL⁃CDK2⁃shRNA，检测了其基因沉默效应和抑瘤效应，本实验在前期实验的基础上，选择B16⁃F1黑素瘤细胞，进行体内、体外试验，观察CDK2基因被重组慢病毒pUL⁃CDK2⁃shRNA沉默后，化疗药物DTIC对黑素瘤的生长抑制作用，为临床应用提供实验依据。

材料与方法

一、材料

B16⁃F1细胞（中国典型培养物保藏中心），DMEM培养液、胰蛋白酶（美国Hycolone公司），胎牛血清（杭州四季青公司），噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、碘化丙锭（PI）、DTIC（美国Sigma公司），AnnexinV⁃FITC/PI（南京凯基生物科技发展有限公司），Tunel试剂盒（德国Roche公司）。

二、方法

1.细胞培养：雌性小鼠C57BL/6［许可证号SYXK（豫）2011⁃0001，合格证SCXK2012⁃0001］，5 ～6周龄，体重（12±2）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，SPF级环境饲养；小鼠黑素瘤细胞株B16⁃F1，用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM培养液，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养，取对数生长期的细胞用于实验。

2.细胞分组：B16⁃F1细胞分为4组。①对照组：将B16⁃F1细胞按3 × 103个/孔接种于96孔板，12 h后不干预；②CDK2⁃shRNA 组：利用 pUL⁃CDK2⁃shRNA重组慢病毒感染B16⁃F1细胞，将感染的B16⁃F1细胞按3×103个/孔接种于96孔板，12 h后不干预；③DTIC组：将B16⁃F1细胞按3 × 103个/孔接种于96孔板，12 h后用250 μmol/L的DTIC孵育；④CDK2⁃shRNA+DTIC组：用CDK2⁃shRNA重组慢病毒感染B16⁃F1细胞，将感染的B16⁃F1细胞按3 × 103个/孔接种于96孔板，12 h后用250 μmol/L的DTIC孵育。

3.MTT实验检测各组细胞的生长抑制作用：将上述4组细胞，每组设3个复孔取均值，并设1组空白对照孔，分别于24、48、72、96 h加入MTT溶液，培养4 h后吸去孔内培养液，加入DMSO 150 μl，避光，置摇床振荡5 min（150 r/min），使结晶充分溶解，置酶标仪检测570 nm的A值，空白对照调零，取各组A值的平均值，计算细胞相对存活率。细胞相对存活率%=实验组平均A值/对照组平均A值 ×100%。实验重复3次取均值。

采用两药相互作用指数（coefficient of drug interaction，CDI）评价两药相互作用性质。按下列公式计算CDI值：CDI=AB/（A×B），A或B是单药组与对照组吸光度值的比值，AB为两药联合组与对照组吸光度值的比值。CDI=1，两药作用性质为相加；CDI＜ 1，两药作用性质为协同；CDI＜ 0.7时，两药作用性质为显著协同作用；CDI＞1，则两药作用性质为拮抗［17］。

4.AnnexinV⁃FITC/PI双染法检测细胞凋亡：细胞分组方式及实验干预方式与MTT实验相同，不同之处是细胞按1.5×105个/孔接种于6孔板，干预72 h后用胰酶消化，离心收集各组细胞，预冷PBS洗2遍，用缓冲液结合缓冲液重悬，制成单细胞悬液，密度为1 × 106/ml。取0.1 ml细胞悬液，加入5 μl FITC⁃AnnexinV，5 μl PI混匀后，室温避光反应15 min，流式细胞仪检测，Cell Quest软件分析结果。

5.荷黑素瘤小鼠模型的建立及分组：收集对数生长期B16⁃F1细胞，离心、用PBS洗涤、重悬、细胞计数、按2×106个细胞/瘤的剂量，接种于C57BL/6小鼠的右侧腹股沟皮下。待瘤块直径为2 mm时，将荷瘤小鼠分为4组，每组5只。①对照组：采用癌灶多点注射的方法向瘤子注射PBS，观察18 d；②CDK2⁃shRNA组：采用癌灶多点注射的方法将pUL⁃CDK2⁃shRNA重组慢病毒（滴度为2× 108TU/ml）导入肿瘤灶，每只小鼠200 μl，隔日1次，共6次，观察18 d；③DTIC组：每隔3天按70 mg/kg剂量腹腔注射DTIC；④CDK2⁃shRNA+DTIC组：用②和③的方式联合处理。

6.体内抑瘤效应的观察：每天观察小鼠肿瘤生长情况，每隔2天用游标卡尺测量肿瘤的长短径，按下列公式计算肿瘤体积：肿瘤体积=0.5×瘤体长径×（瘤体短径）2，然后根据肿瘤体积绘制生长曲线。

7.抑瘤率测定：实验18 d后，剥出皮下完整瘤块，放在称量纸上称重，按以下公式计算肿瘤生长抑制率：抑瘤率=（对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%。

8.TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡：石蜡切片脱蜡水化，蛋白酶K 37℃处理组织30 min，PBS漂洗3次后，滴加反应混合物，阴性对照仅加50 μl荧光素标记的dUTP液，37℃加盖玻片在暗室盒中反应1 h，PBS漂洗3次，滴加POD 50 μl，在湿盒中37 ℃反应30 min，PBS漂洗3次，滴加AEC显色，苏木素衬染1 min，水洗蓝化，封片剂封片，立即镜检拍照，核呈红色的细胞为凋亡细胞。每例随机观察5个高倍镜视野（×400），计算细胞凋亡指数（apoptosis index，AI），AI=（TUNEL染色阳性细胞数/肿瘤细胞数）×100%。

9.统计学分析：采用SPSS 21.0统计软件分析，计量资料用±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LDS方法，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、细胞生长抑制作用检测

分别于24、48、72、96 h用MTT法检测各组细胞的生长抑制作用，结果显示，与对照组相比，CDK2⁃shRNA组、DTIC组、CDK2⁃shRNA+DTIC组细胞相对存活率差异有统计学意义（F24h=514.2，P24h＜0.05；F48h=541.0，P48h＜ 0.05；F72h=458.04，P72h＜0.05；F96h=660.6，P96h＜ 0.05），均显著降低，表现出对B16⁃F1细胞的生长抑制作用，且呈时间依赖关系，其中各时间点CDK2⁃shRNA+DTIC组的细胞相对存活率最低，显著低于DTIC组（P＜0.05）。计算各时间点的CDI值，均＜0.7，说明重组慢病毒沉默CDK2基因后可增加DTIC对黑素瘤的生长抑制作用，且两者具有显著协同效应。见表1。

表1 噻唑蓝法检测各种干预对B16⁃F1细胞的生长抑制作用（±s）

注：n=3。a：与对照组比，P ＜ 0.05；b：与DITC组比，P ＜ 0.05。DTIC：达卡巴嗪；CDK：周期素依赖性蛋白激酶；CDI值：两药相互作用指数

不同时间点细胞相对存活率（%）组别对照组CDK2⁃shRNA组DTIC组CDK2⁃shRNA+DTIC组F值P值CDI值24 h 100 60.9±2.1a 70.1±1.5a 47.9±2.2ab 514.2＜0.05a 0.55 48 h 100 46.3±2.5a 50.4±2.3a 37.6±2.4ab 541.0 96 h 100 34.3±1.6a 41.4±2.2a 25.9±2.5ab 660.6 0.41 72 h 100 40.6±2.8a 45.2±3.7a 28.7±2.1ab 458.04＜0.05b 0.320.31

二、细胞凋亡检测

AnnexinV⁃FITC/PI双染法检测72 h细胞凋亡，对照组、CDK2⁃shRNA组、DTIC组、CDK2⁃shRNA+DTIC组细胞凋亡率分别为（6.3± 1.2）%、（25.1±3.3）%、（15.6 ± 2.2）%、（45.6 ± 3.5）%。与对照组相比，CDK2⁃shRNA组、DTIC组、CDK2⁃shRNA+DTIC组细胞凋亡率差异有统计学意义（F=115.46，CDK2⁃shRNA组比对照组，P＜0.01；DTIC组比对照组，P=0.003；CDK2⁃shRNA+DTIC组比对照组，P＜0.01），均显著升高，其中CDK2⁃shRNA+DTIC组细胞凋亡率最高，显著高于DTIC组（P＜0.01），说明沉默CDK2基因后，DTIC对黑素瘤细胞的生长抑制效应增加主要是通过细胞凋亡的诱导实现的。见图1。

图1 AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡率 Q2为晚期凋亡，Q4为早期凋亡（从左至右依次为对照组、CDK2⁃shRNA组、DTIC组、CDK2⁃shRNA+DTIC组）

三、小鼠黑素瘤生长抑制作用检测

给C57BL/6小鼠皮下注射一定量的B16⁃F1细胞，构建皮下黑素瘤模型，第3天可见5 mm3的瘤块，然后将其分为4组，分别给予PBS、CDK2⁃shRNA、DTIC、CDK2⁃shRNA+DTIC进行治疗，观察18 d，每隔2天测量肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线，结果显示，从治疗的第6天开始，对照组、CDK2⁃shRNA组、DTIC组及CDK2⁃shRNA+DTIC组的肿瘤 体 积 分 别 为（185.44 ± 68.97）mm3、（83.91 ±14.33）mm3、（123.70 ± 20.85）mm3、（34.54 ± 10.72）mm3。与对照组相比CDK2⁃shRNA组、DTIC组及CDK2⁃shRNA+DTIC组的肿瘤生长速度明显降低（F=11.819，CDK2⁃shRNA组比对照组，P=0.001；DTIC组比对照组，P=0.032；CDK2⁃shRNA+DTIC组比对照组P＜ 0.01），而CDK2⁃shRNA+DTIC组的肿瘤生长速度明显低于DTIC组（P=0.04）。18 d治疗结束后，处死小鼠，剥出肿瘤，称重，计算肿瘤生长抑制率。结果显示，与对照组相比，CDK2⁃shRNA组、DTIC组、CDK2⁃shRNA+DTIC组肿瘤生长抑制率分别为52.2%、41.2%、86.4%，其中CDK2⁃shRNA+DTIC组肿瘤生长抑制率最高。实验结果说明，沉默CDK2基因可以降低肿瘤的生长速度，增强DTIC对黑素瘤的生长抑制率。见图2。

图2 各种干预对B16⁃F1细胞移植瘤的生长抑制效应 2A：肿瘤生长曲线 a：治疗第6天，与对照组比较，P＜0.05；b：与达卡巴嗪组比较，P＜0.05；2B：治疗结束肿瘤外观 从左至右依次为对照组、DTIC组、CDK2⁃shRNA组、CDK2⁃shRNA+DTIC组。与对照组相比，其他3组的肿瘤体积明显缩小，其中CDK2-shRNA+DTIC组肿瘤体积最小

四、小鼠黑素瘤组织细胞凋亡结果

TUNEL染色检测肿瘤组织细胞凋亡情况，细胞核呈红色为阳性凋亡细胞，随机选取5个高倍镜（×400）观察凋亡细胞数，计算细胞凋亡指数（AI），结果显示，对照组、CDK2⁃shRNA组、DTIC组、CDK2⁃shRNA+DTIC组的细胞凋亡指数分别为（7.78±1.15）%、（32.93 ± 3.72）%、（21.62 ± 3.54）%、（63.29 ±4.74）%，结果说明，与对照组相比，CDK2⁃shRNA组、DTIC组、CDK2⁃shRNA+DTIC组的瘤细胞凋亡指数显著升高（F=222.25，CDK2⁃shRNA组比对照组，P＜ 0.01；DTIC组比对照组，P＜ 0.01；CDK2⁃shRNA+DTIC组比对照组，P＜ 0.01），其中CDK2⁃shRNA+DTIC组的细胞凋亡指数最高，显著高于DTIC组（P＜0.01）。说明靶向沉默CDK2基因后，DTIC可诱导更多的细胞凋亡，这可能是其有效抑制肿瘤生长的潜在机制。见图3。

图3 TUNEL染色检测肿瘤细胞凋亡（AEC染色，×400，红染的细胞核为凋亡细胞） 第1～4排分别为对照组、CDK2-shRNA组、DTIC组、CDK2-shRNA+DTIC组，与对照组相比，CDK2-shRNA+DTIC组的的细胞凋亡指数最高，显著高于DTIC组，P＜0.05

讨 论

DTIC是一种细胞周期非特异性抗肿瘤烷化剂，主要用于治疗转移性黑素瘤，具有直接的细胞毒作用，通过对核酸的甲基化或直接损伤DNA达到抗癌作用，其不良反应主要是抑制正常细胞增殖［18］。临床试验显示其应答率不高，中位生存5～6个月，单药的有效率仅为10%，具有较大毒副作用［6⁃8］。其他用于治疗黑素瘤的化疗药物，例如，替莫唑胺、铂类似物、长春花碱类、亚硝脲类、紫杉烷类等；或者免疫制剂例如，干扰素、白细胞介素2比起DTIC没有表现出明显的优势［6⁃8］。由于单药化疗的有效率有限，有人提出了联合化疗方案。但联合化疗例如，DTIC+卡莫司汀+顺铂+他莫昔芬，顺铂+长春碱+DTIC，或者生物化疗例如，干扰素α+白细胞介素2+3种不同的化疗药物（顺铂/长春碱/DTIC），这些联合治疗方案与DTIC单药治疗相比未显示出总体存活优势，或者具有更高的毒性［6⁃9］。目前，黑素瘤的免疫治疗受到重视，抗CTLA⁃4抗体类药物和抗PD⁃1/PD⁃L1抗体类药物相继上市，它们对黑素瘤的治疗均显示出一定疗效，但也有局限性［18］。为了探讨治疗黑素瘤的新方法，我们前期［14⁃16］构建了 3 个重组慢病毒质粒 pUL⁃CDK2⁃shRNA1～3和1个阴性对照重组慢病毒质粒pUL⁃NC⁃shRNA，筛选出了基因沉默效应最好的重组慢病毒质粒用于体内外实验，显示出对小鼠黑素瘤较好抑瘤效应。本研究中，我们用前期筛选的基因沉默效应最好的重组慢病毒pUL⁃CDK2⁃shRNA与DTIC联用治疗B16⁃F1黑素瘤，探讨其抗瘤效应。

本研究MTT法检测24、48、72、96 h各组细胞的生长抑制结果显示，DTIC组在上述不同时间点的细胞相对存活率分别为（70.1±1.5）%、（50.4±2.3）%、（45.2±3.7）%、（41.4±2.2）%，DTIC与重组慢病毒pUL⁃CDK2⁃shRNA联用后，在上述不同时间点的细胞相对存活率分别为（47.9±2.2）%、（37.6±2.4）%、（28.7±2.1）%、（25.9±2.5）%，显著降低，两药相互作用指数（CDI值）均P＜0.7，表明重组慢病毒pUL⁃CDK2⁃shRNA沉默CDK2基因后，可以增加DTIC对黑素瘤细胞的生长抑制率，且两者有显著协同效应。在体外实验的基础上，探讨了CDK2基因沉默后，体内试验是否也能增强DTIC的抑瘤效应。我们选用B16⁃F1细胞移植瘤进行实验，结果显示，DTIC单用对移植瘤的生长抑制率是41.2%，DTIC与重组慢病毒pUL⁃CDK2⁃shRNA联用对移植瘤的生长抑制率是86.4%，显著高于DTIC单独的治疗效应。

两药联用出现协同效应其机制是复杂的。为了探讨pUL⁃CDK2⁃shRNA与DTIC联用出现协同效应的潜在机制，用AnnexinV⁃FITC/PI双染法检测了细胞凋亡情况，结果显示，DTIC与重组慢病毒pUL⁃CDK2⁃shRNA联合后的细胞凋亡率（45.6±3.5%）显著高于DTIC单药组（15.6±2.2%）。本研究用TUNEL染色法检测了组织细胞的凋亡情况，结果显示，DTIC与重组慢病毒pUL⁃CDK2⁃shRNA联合后组织细胞凋亡指数（63.29±4.74）%显著高于DTIC单药组（21.62±3.54）%。本文结果显示，重组慢病毒pUL⁃CDK2⁃shRNA可以增强DTIC对黑素瘤的抑瘤效应，主要是通过凋亡效应的增强而实现的。总之，重组慢病毒pUL⁃CDK2⁃shRNA沉默CDK2基因后，可以增强DTIC对B16⁃F1小鼠黑素瘤的生长抑制作用，显示出显著协同效应，为黑素瘤治疗提供了一个新的思路。

［1］Tripp MK,Watson M,Balk SJ,et al.State of the science on prevention and screening to reduce melanoma incidence and mortality:The time is now［J］.CA Cancer J Clin,2016.DOI:10.3322/caac.21352.

［2］Mayer JE,Swetter SM,Fu T,et al.Screening,early detection,education,and trends for melanoma:current status（2007⁃2013）and future directions:Part I.Epidemiology,high⁃risk groups,clinical strategies,and diagnostic technology［J］.J Am Acad Dermatol,2014,71（4）:599.e1⁃599.e12;quiz 610,599.e12.DOI:10.1016/j.jaad.2014.05.046.

［3］Mozzillo N,Ascierto PA.Melanoma:the role of surgery in the era of new therapies［J］.J Transl Med,2014,12:195.DOI:10.1186/1479⁃5876⁃12⁃195.

［4］van Zeijl MC,van den Eertwegh AJ,Haanen JB,et al.（Neo）adjuvant systemic therapy for melanoma［J］.Eur J Surg Oncol,2016.DOI:10.1016/j.ejso.2016.07.001.

［5］Bhatia S,Thompson JA.Systemic therapy for metastatic melanoma in 2012:dawn of a new era［J］.J Natl Compr Canc Netw,2012,10（3）:403⁃412.

［6］Wilson MA,Schuchter LM.Chemotherapy for Melanoma［J］.Cancer Treat Res,2016,167:209⁃229.DOI:10.1007/978⁃3⁃319⁃22539⁃5_8.

［7］Hao M,Song F,Du X,et al.Advances in targeted therapy for unresectable melanoma:new drugs and combinations［J］.Cancer Lett,2015,359（1）:1⁃8.DOI:10.1016/j.canlet.2014.12.050.

［8］Agarwala SS.Current systemic therapy for metastatic melanoma［J］.Expert Rev Anticancer Ther,2009,9（5）:587 ⁃595.DOI:10.1586/era.09.25.

［9］Yang AS,Chapman PB.The history and future of chemotherapy for melanoma［J］.Hematol Oncol Clin North Am,2009,23（3）:583⁃597,x.DOI:10.1016/j.hoc.2009.03.006.

［10］Chohan TA,Qian H,Pan Y,et al.Cyclin⁃dependent kinase⁃2 as a target for cancer therapy:progress in the development of CDK2 inhibitors as anti⁃cancer agents［J］.Curr Med Chem,2015,22（2）:237⁃263.

［11］Flores O,Wang Z,Knudsen KE,et al.Nuclear targeting of cyclin⁃dependent kinase 2 reveals essential roles of cyclin⁃dependent kinase 2 localization and cyclin E in vitamin D⁃mediated growth inhibition［J］.Endocrinology,2010,151（3）:896 ⁃908.DOI:10.1210/en.2009⁃1116.

［12］Abdullah C,Wang X,Becker D.Expression analysis and mole⁃cular targeting of cyclin⁃dependent kinases in advanced melanoma［J］.Cell Cycle,2011,10（6）:977⁃988.DOI:10.4161/cc.10.6.15079.

［13］Du J,Widlund HR,Horstmann MA,et al.Critical role of CDK2 formelanoma growth linked to its melanocyte⁃specific transcriptional regulation by MITF［J］.Cancer Cell,2004,6（6）:565⁃576.DOI:10.1016/j.ccr.2004.10.014.

［14］晋佳路，朱仁书，谢育媛等.CDK2 shRNA慢病毒载体的构建及其基因沉默效应研究［J］.中国老年学杂志,2015,35（16）:4483⁃4485.DOI:10.3969/j.issn.1005⁃9202.2015.16.028.

［15］晋佳路,朱仁书,谢育媛,等.慢病毒载体介导CDK2基因沉默对黑素瘤B16⁃F1细胞生物学行为的影响［J］.中国肿瘤生物治疗 杂 志,2016,23（2）:243⁃249.DOI:10.3872/j.issn.1007⁃385X.2016.02.015.

［16］晋佳路,朱仁书,谢育媛,等.shRNA沉默CDK2基因对B16⁃F1细胞小鼠皮下移植瘤的影响［J］.中华肿瘤防治杂志,2016,23（9）:592⁃596.

［17］Soica C,Oprean C,Borcan F,et al.The synergistic biologic activity ofoleanolic and ursolic acids in complex with hydroxypropyl⁃γ⁃cyclodextrin［J］.Molecules,2014,19（4）:4924⁃4940.DOI:10.3390/molecules19044924.

［18］Baharara J,Amini E,Nikdel N,et al.The Cytotoxicity of dacarbazine potentiated by sea cucumber saponin in resistant B16F10 melanoma cells through apoptosis induction ［J］.Avicenna J Med Biotechnol,2016,8（3）:112⁃119.

Inhibitory effect of CDK2 gene silencing combined with dacarbazine on the growth of B16⁃F1 melanoma

Jin Jialu,Zhu Renshu,Xie Yuyuan,Liu Hongchun
Department of Laboratory Medicine,Medical School of Hebi Polytechnic,Hebi 458030,Henan,China（Jin JL,Zhu RS）;Institute for Biological Products Control,Hubei Institute for Food and Drug Control,Wuhan 430064,China（Xie YY）;Department of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China（Liu HC）

Liu Hongchun,Email:xingyunerliu@163.com

ObjectiveTo evaluate the antitumor effect of dacarbazine（DTIC）on B16 ⁃F1 melanoma after CDK2 gene silencing.MethodsCultured B16⁃F1 melanoma cells were divided into 4 groups:control group receiving no treatment,CDK2⁃shRNA group infected with a recombinant lentivirus pUL⁃CDK2⁃shRNA,DTIC group cultured in 96⁃well plates followed 12 hours later by the treatment with 250 μmol/L DTIC,CDK2⁃shRNA+DTIC group infected with pUL⁃CDK2⁃shRNA followed 12 hours later by the treatment with 250 μmol/L DTIC.MTT assay was performed to evaluate the growth inhibition of B16 ⁃F1 melanoma cells,and coefficient of drug interaction（CDI）was calculated.AnnexinV ⁃FITC/PI double staining was conducted to detect cell apoptosis.C57BL/6 mice were subcutaneously injected with B16⁃F1 cells at exponential growth phase into the right groin to establish melanoma⁃bearing mouse models.Twenty mouse models were randomly and equally divided into 4 groups:control mouse group injected with phosphate⁃buffered solution（PBS）into tumors,CDK2⁃shRNA mouse group injected with pUL⁃CDK2⁃shRNA into tumors,DTIC mouse group injected with DTIC into the abdominal cavity,and CDK2⁃shRNA+DTIC mouse group treated with pUL⁃CDK2⁃shRNA and DTIC.The animal experiment lasted 18 days,and the tumor growth curve was drawn.After 18⁃day treatment,all the mice were sacrificed,and tumors were isolated and weighed.The tumor growth inhibition rate was calculated,and the tumor cell apoptosis was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase⁃mediated dUTP nick⁃end⁃labeling（TUNEL）.ResultsAfter 72⁃hour culture,compared with the control group,the CDK2⁃shRNA group,DTIC group,and CDK2⁃shRNA+DTIC group showed significantly decreased relative cell survival rates（40.6% ±2.8%,45.2% ±3.7%,28.7% ±2.1%,respectively;F=458.04,P＜0.05）,but significantly increased cell apoptosis rates（25.1%±3.3%,15.6%±2.2%,45.6% ±3.5%,respectively;F=115.46,P＜0.05）.Additionally,CDK2⁃shRNA+DTIC group showed significantly lower relative cell survival rates（P＜ 0.01）,but higher cell apoptosis rates（P＜ 0.01）compared with the DTIC group.The CDI value was less than 0.7.On the sixth day after thein vivotreatment,the tumor volumes in the control mouse group,CDK2⁃shRNA mouse group,DTIC mouse group,and CDK2⁃shRNA+DTIC mouse group were（185.44 ± 68.97）mm3,（83.91 ± 14.33）mm3,（123.70 ± 20.85）mm3,and（34.54 ± 10.72）mm3respectively.From then on,the CDK2⁃shRNA mouse group,DTIC mouse group,and CDK2⁃shRNA+DTIC mouse group showed significantly decreased tumor growth rates compared with the control mouse group（F=11.819,P＜ 0.05）,and the tumor growth rate was significantly lower in the CDK2⁃shRNA+DTIC mouse group than in the DTIC mouse group（P=0.04）.The calculated tumor growth inhibition rates in the CDK2⁃shRNA mouse group,DTIC mouse group and CDK2⁃shRNA+DTIC mouse group were 52.2%,41.2%and 86.4%respectively.Compared with the control mouse group,the CDK2⁃shRNA mouse group,DTIC mouse group,and CDK2⁃shRNA+DTIC mouse group showed significantly increased tumor cell apoptosis indice（32.93% ±3.72%,21.62% ±3.54%,63.29% ±4.74%respectively;F=222.25,P＜ 0.05）.Moreover,the tumor cell apoptosis index was significantly higher in the CDK2⁃shRNA+DTIC mouse group than in the DTIC mouse group（P＜ 0.01）.ConclusionCDK2 gene silencing can enhance the inhibitory effect of DTIC on the growth of melanoma,and show a synergistic effect with DTIC,likely by increasing the apoptosis of tumor cells.

Melanoma;Dacarbazine;Cyclin⁃dependent kinase 2;Gene silencing;Apoptosis

刘红春，Email：xingyunerliu@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2017.09.010

河南省科技发展计划项目（122300410193）；河南省高等学校青年骨干教师资助计划项目（2011GGJS⁃262）

Fund programs:Science and Technology Development Program of Henan Province of China（122300410193）;Foundation for University Young Key Teachers of Henan Province（2011GGJS⁃262）

2016⁃11⁃18）

（本文编辑：吴晓初）