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HPLC同时测定鸭跖草提取物中咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素的含量

2017-11-04史培培童圣灵梁鹏飞

关键词:鼠李糖槲皮素咖啡

曹 旭, 史培培, 童圣灵, 梁鹏飞, 蔡 芳, 胡 杨

(1.江苏吉贝尔药业股份有限公司, 江苏 镇江 212009; 2.镇江华康大药房连锁有限公司, 江苏 扬中 212200)

HPLC同时测定鸭跖草提取物中咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素的含量

曹 旭1, 史培培2, 童圣灵1, 梁鹏飞1, 蔡 芳1, 胡 杨1

(1.江苏吉贝尔药业股份有限公司, 江苏 镇江 212009; 2.镇江华康大药房连锁有限公司, 江苏 扬中 212200)

采用高效液相色谱法同时测定鸭跖草提取物中咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素的含量。色谱条件为:色谱柱为Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)柱,以甲醇(A)-体积分数0.1%甲酸水(B)梯度洗脱:0~17 min,22% A~42% A;17~28 min,42% A~56% A;28~40 min,56% A~90% A,检测波长为350 nm,流速为1 mL/min,柱温为35 ℃。咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素分别在2.16~86.4 mg/L、6.445~257.8 mg/L和3.293~131.7 mg/L范围内线性关系良好,平均回收率分别为98.36%,99.42%和98.00%。该方法准确、可靠、重复性好,可用于鸭跖草提取物的质量评价与控制。

鸭跖草提取物; 咖啡酸; 槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷; 异荭草素; 高效液相色谱法

鸭跖草为鸭跖草科植物鸭跖草(CommelinacommunisL.)的干燥茎叶部分,药性甘、淡、寒,归肺、胃、小肠经,具清热泻火、解毒、利水消肿之功效,常用于感冒发热、热病烦渴、咽喉肿痛、水肿尿少、热淋涩痛、痈肿疔毒的治疗[1-2]。鸭跖草始载于《本草拾遗》,现代药理研究表明,鸭跖草具有抗炎、降血糖、降血脂及抗氧化等药理作用[3-5]。近年有学者对鸭跖草的化学成分进行了研究[6-7]。在前期研究工作中采用HPLC-MS初步鉴定本试验中鸭跖草提取物的主要成分为咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素,而尚未对鸭跖草中此3种成分测定研究,故本研究采用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)对鸭跖草提取物中咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素的含量进行测定,为鸭跖草的新药开发及功能性保健产品的开发提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪 器

LC-20A和SPD-20AT检测器(岛津株式会社);N2000双通道色谱站(浙江大学智能信息工程研究所);Buchi旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司);微量移液器(北京大龙仪器公司);超声清洗机(上海易净超声波仪器)。

1.2 材 料

咖啡酸对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110885-200102);槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷对照品(上海源叶,纯度≥98%,批号:140528);异荭草素对照品(上海纯优,纯度≥97%,批号:P0152);鸭跖草提取物(自制,批号:20160903,20160924,20161011);色谱纯甲醇(美国Tedia);纯化水(自制),其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相组成:甲醇(A)-体积分数0.1%甲酸水(B);梯度洗脱:0~17 min,22% A~42% A;17~28 min,42% A~56% A;28~40 min,56% A~90% A;流速:1 mL/min;柱温35 ℃;进样量:20 μL;检测波长:350 nm。

2.2 鸭跖草提取物的制备

称取鸭跖草适量,粉碎,过40目筛,加10倍量水,100 ℃回流提取2次,抽滤,合并两次提取液,减压浓缩至相对密度为1.15,加体积分数95%乙醇使含醇量达50%,醇沉静置12 h,离心去沉淀,上清减压浓缩除去乙醇,过HPD826大孔吸附树脂,依次用水及体积分数30%乙醇洗涤2个柱体积(BV)以除去水溶性杂质及部分醇溶性杂质,用体积分数75%乙醇洗脱5 BV,收集洗脱液,回收乙醇并真空干燥,干燥后经粉碎机粉碎,并过80目筛,备用。

2.3 溶液制备

2.3.1 对照品溶液的配制

精密称取咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素对照品适量于量瓶中,用甲醇溶解并定容,配制成含咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素浓度分别为86.4、257.8、131.7 mg/L的混合对照品溶液储备液。分别吸取上述储备液5、2.5、1、0.5、0.25 mL于5个10 mL量瓶中,甲醇稀释至刻度,即得咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素浓度分别为2.16、4.32、8.64、21.6、43.2、86.4 mg/L,6.445、12.89、25.78、64.45、128.9、257.8 mg/L和3.293、6.585、13.17、32.93、65.85、131.7 mg/L的系列混合对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备

取鸭跖草提取物100 mg,精密称定,置入10 mL量瓶,用甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,0.45 μm微孔滤膜滤过后备用。

2.4 方法专属性

按2.1色谱条件进样分析,得到对照品和鸭跖草提取物的HPLC色谱图,见图1。在该色谱条件下,咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素的分离度良好。

2.5 线性关系考察

取咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素浓度分别为86.4、43.2、21.6、8.64、4.32、2.16 mg/L,257.8、128.9、64.45、25.78、12.89、6.445 mg/L和131.7、65.85、32.93、13.17、6.585、3.293 mg/L的系列对照品溶液,按2.1色谱条件测定峰面积,并以峰面积(A)对对照品溶液浓度(C)进行线性回归,得标准曲线,结果咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素分别在2.16~86.4 mg/L、6.445~257.8 mg/L和3.293~131.7 mg/L范围内线性关系良好,三者的回归方程分别为A=15 563C-2273.5(r=0.9998),A=22 649C-2571.3(r=0.9998),A=36 951C-17 225(r=0.9997)。

2.6 精密度试验

精密吸取含咖啡酸8.64 mg/L、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷25.78 mg/L和异荭草素13.17 mg/L的对照品溶液20 μL,按2.1色谱条件重复进样6次,记录三者峰面积,结果咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素峰面积的RSD分别为0.71%、0.56%、0.72%,表明仪器精密度良好。

2.7 中间精密度试验

称取鸭跖草提取物(批号20160903)约100 mg,按2.3.2方法配制供试品溶液,分别由不同人员(A、B)在不同仪器(LC-20A、LC-2010AHT)用不同色谱柱(Phenomenex C18、Kromasil C18)操作,按2.1色谱条件进样,测得咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素的平均含量分别为1.095、2.974、1.282 mg/g,三者含量的RSD分别为1.46%、0.87%、1.34%,表明方法中间精密度良好。

1.咖啡酸; 2.槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷; 3.异荭草素图1 鸭跖草提取物及对照品色谱图

2.8 重复性试验

称取鸭跖草提取物(批号:20160903)6份,每份约100 mg,按2.3.2方法配制供试品溶液,再按2.1色谱条件进样,记录咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素的峰面积,计算三者含量。结果咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素在鸭跖草提取物的含量分别为1.096、2.973、1.284 mg/g,三者含量的RSD分别为1.37%、1.05%、1.26%,均小于2%,表明方法重复性良好。

2.9 稳定性试验

精密吸取2.3.2供试品溶液,按2.1色谱条件,分别在0、2、4、8、12、24 h进样测定,记录咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素峰面积,结果咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素峰面积RSD分别为1.41%、0.98%、1.27%,均小于2%,表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.10 加样回收率试验

称取已知含量的鸭跖草提取物(20160903批)6份(每份约50 mg)于10 mL容量瓶中,分别精密加入咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素浓度分别为43.2、128.9、65.85 mg/L的混合对照品溶液1 mL,加适量甲醇后超声溶解并定容至刻度,摇匀,0.45 μm微孔滤膜滤过,进样分析,记录峰面积,计算加样回收率及RSD值,结果见表1。

表1 加样回收率结果

2.11 样品测定

称取3批鸭跖草提取物各1份,每份100 mg,精密称定,按2.3.2方法制备供试品溶液,按2.1色谱条件测定,记录峰面积,通过回归方程分别计算鸭跖草提取物中咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素的含量。结果见表2。

表2 鸭跖草提取物中咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素含量

3 讨 论

3.1 检测波长的选择

咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷及异荭草素对照品分别经紫外全波长扫描,结果咖啡酸在323 nm波长处有最大吸收,槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷在368 nm波长处有最大吸收,异荭草素在350 nm 波长处有最大吸收,综合考虑后选择350 nm作为检测波长。

3.2 流动相的选择

在选择流动相比例时,曾尝试采用甲醇-水等度洗脱系统同时测定咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素3种成分,结果分离效果较差或保留时间相对过长。因此,采用了甲醇-水梯度洗脱系统对鸭跖草提取物中3种成分进行检测,结果较为理想,同时加体积分数0.1%的甲酸调整峰型,结果峰型良好。

4 结 论

本研究采用HPLC同时测定鸭跖草提取物中咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素的含量,该方法快速、准确,重复性高,可用于鸭跖草提取物的质量评价与控制,为鸭跖草功能性产品的研究开发提供依据。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[S].北京:中国医药科技出版社,2015:282.

[2] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草:第5册[M].上海:上海科学技术出版社,1999:299-301.

[3] 余昕,朱烨,欧丽兰,等.鸭跖草抗炎活性部位筛选及抗炎机制[J].中成药,2015,37(8):1824-1827.

[4] 谭志荣,李沛波,袁干军.鸭跖草水提取物降血糖作用的实验研究[J].中国热带医学,2009,9(8):1457-1461.

[5] 王垣芳,杨美子,李祖成,等.鸭跖草对高脂血症小鼠血脂代谢及抗氧化能力的影响[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(16):273-277.

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[7] 南海函,林函,蔡诗庆.鸭跖草化学成分的研究[J].中成药,2010,32(9):1556-1558.

[责任编辑:谢 平]

Simultaneous determination of caffeic acid, quercetin-3-O-α-L-rhamnoside and isoorientin in extract ofCommelinacommunisL. by HPLC

CAO Xu1, SHI Pei-pei2, TONG Sheng-ling1, LIANG Peng-fei1, CAI Fang1, HU Yang1

(1.Jiangsu Jibrier Pharmaceutical Joint Stock Co., Ltd., Zhenjiang 212009, China;2.Zhenjiang Huakang Pharmacy Chain Co., Ltd., Yangzhong 212200, China)

The study uses HPLC method for simultaneous determination of the content of caffeic acid, quercetin-3-O-α-L-rhamnoside and isoorientin in extract ofCommelinacommunisL.. The HPLC analysis has been carried out on Phenomenex C18column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) with methanol(A)-0.1% formic acid(B) gradient elution:0 min~17 min, 22% A~42% A;17 min~28 min, 42% A~56% A;28 min~40 min, 56% A~90% A at a flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength is 350 nm and the column temperature is 35 ℃. Good linear relationship has been found in the the range of 2.16~86.4 mg/L for caffeic acid, 6.445~257.8 mg/L for quercetin-3-O-α-L-rhamnoside, 3.293~131.7 mg/L for isoorientin. Their average recoveries are 98.36%, 99.42% and 98.00%, respectively. The method is accurate, reliable, and can be used for the quality control and evaluation of extract ofCommelinacommunisL..

extract ofCommelinacommunisL.; caffeic acid; quercetin-3-O-α-L-rhamnoside; isoorientin; HPLC

R284.1; O657.7+2

A

2096-3998(2017)05-0065-05

2017-06-02

2017-06-22

曹旭(1988—),男,江苏省扬中市人,江苏吉贝尔药业股份有限公司工程师,硕士,主要研究方向为新药制剂及质量标准。

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