陈文静，梁文仪，李 师，吴玲芳，崔雅萍，亓 旗，叶 婷，梁林金，张兰珍

（北京中医药大学中药学院 北京 100102）

基于HPLC-MSn和化学计量学的指纹图谱在毛诃子鞣质部位质量评价中的应用

陈文静，梁文仪，李 师，吴玲芳，崔雅萍，亓 旗，叶 婷，梁林金，张兰珍＊

（北京中医药大学中药学院 北京 100102）

目的：建立毛诃子鞣质部位HPLC指纹图谱。方法：采用Atlantic T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为乙腈-0.2%冰醋酸水溶液，梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1，进样量20 μL，柱温30℃。采用相似度软件和SPSS、SIMCA软件对11批毛诃子鞣质部位的色谱数据进行化学计量学分析。结果：标定出20个共有峰。结果显示11批毛诃子鞣质部位相似度在0.832-0.973之间，只有新疆产地药材的鞣质部位的相似度在0.9以下。聚类分析将鞣质部位大致分为3类，与主成分分析结果一致。偏最小二乘判别分析找到1、13和14号峰可能是鉴别毛诃子样品最主要的色谱峰。采用HPLC-MSn方法总结出毛诃子鞣质部位中14个化合物的液质信息。结论：将毛诃子鞣质部位HPLC指纹图谱数据采用化学计量学分析方法进行分析，方法快速、简便、重复性好，可作为藏药毛诃子鞣质部位质量控制有效方法之一。

毛诃子 鞣质部位 化学计量学 指纹图谱

毛诃子始载于《新修本草》，是使君子科植物毗黎勒 Terminalia billerica（Gaertn.）Roxb.的干燥成熟果实[1]。又名均保奈、噶拉珠玛、作贝相、莫合、如卡、次木西、巴那、纳合、曼吉德，都离、帕肉拉等[2]，是常用藏药。现代研究发现，毛诃子具有抗氧化、降血栓、抗糖尿病等多种药理活性[3-5]。

毛诃子主要含有鞣质类成分，现代药理学研究证明鞣质类成分具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂、降血糖、抗菌等药理活性[6-9]，与毛诃子药理作用基本一致。本课题组前期报道了不同产地毛诃子药材的指纹图谱和4个主成分含量测定[10]，发现成分含量的差异性较大，为减少药材产地带来的质量差异、扩大药材产地来源，本课题组采用大孔树脂富集工艺对毛诃子鞣质部位进行了富集纯化，鞣质部位含量均能达到50%以上。本实验建立了毛诃子鞣质部位HPLC指纹图谱，采用HPLC-MSn和化学计量学分析方法进行研究，对所收集的11批毛诃子鞣质部位进行聚类分析、主成分分析、偏最小二乘分析，为毛诃子的开发利用和质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters高效液相色谱仪（2487型DAD检测器，Breeze软件）；25 μL进样器（国别+公司全称）；LTQOrbitrap高效液相色谱-质谱联用仪（美国Thermo Fisher公司）；十万分之一电子分析天平（德国赛多利斯集团）；KQ-500DE超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司）；N-1000型旋转蒸发仪（日本東京理化器械株式会社）；HWs26型电热恒温水浴锅（常州荣华仪器有限公司）。

试药：没食子酸（批号141109）购自成都普菲德生物科技有限公司、柯里拉京（批号15101404）、鞣花酸（批号15091807）均购自成都曼斯特生物科技有限公司，纯度≥98%。乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。毛诃子药材分别购自北京市藏医院、安徽亳州药材市场和河北安国药材市场，经北京中医药大学中药鉴定系刘春生教授鉴定为使君子科植物毗黎勒Terminalia billerica（Gaertn.）Roxb.的干燥成熟果实。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[10]

色谱柱：Atlantic T3 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%乙酸水溶液（B），梯度洗脱程序：0-20 min，5%-10%A；20-30 min，10%-15%A；30-60 min，15%-20%A；60-75 min，20%-25%A；75-85 min，25%-50%A；85-95 min，50%-90%A。流速：1 mL·min-1，柱温：25℃，进样量：20 μL。检测波长：254 nm。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取没食子酸对照品5.01 mg，柯里拉京对照品3.04 mg于10 mL量瓶中加50%甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，质量浓度分别为0.501、0.304 mg·mL-1；另精密称取鞣花酸对照品4.22 mg，于10 mL量瓶中加DMSO溶解稀释至刻度，摇匀，质量浓度为0.422 mg·mL-1。

2.3 供试品溶液的制备

按照毛诃子鞣质部位提取纯化工艺制备各产地毛诃子鞣质部位，称取毛诃子鞣质部位粉末约5 mg，置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，待分析。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验

取毛诃子鞣质部位（S1），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，连续进样6次。选择12号峰为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间的RSD均小于1.08%，相对峰面积的RSD均小于3.00%，表明仪器精密度良好。

表1 鞣质部位药材产地

2.4.2 稳定性试验

取毛诃子鞣质部位（S1），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在制样后0、2、4、8、12、24 h进样。以12号峰为参照，各共有峰的相对保留时的RSD均小于1.01%，相对峰面积的RSD均小于3.00%，表明样品稳定性良好。

2.4.3 重复性考察

取毛诃子鞣质部位（S1），按“2.3”项下方法制备供试品溶液6份，分别进样。以12号峰为参照，各共有峰的相对保留时间的RSD均小于0.63%，相对峰面积的RSD均小于2.95%，表明方法重复性良好。

2.5 毛诃子鞣质部位HPLC指纹图谱建立及相似度评价

分别取11批毛诃子鞣质部位，按“2.3”项下方法制备供试品溶液进行测定。采用相似度评价系统（2004 A版）对11批毛诃子鞣质部位色谱数据（图1）进行分析。标定共有峰20个，选择峰面积较大且稳定存在的12号峰鞣花酸为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。毛诃子鞣质部位以S1样品图谱作为参照图谱，相似度在0.832-0.973之间（表2），表明各产地鞣质部位均有良好的相似性。

图1 不同批次毛诃子鞣质部位HPLC指纹图谱

表2 11个批次毛诃子鞣质部位指纹图谱相似度结果

2.6 HPLC-MSn法指认毛诃子鞣质部位主要色谱峰

采用已报道毛诃子药材的HPLC-MSn质谱条件进行负离子模式检测[10]，根据毛诃子鞣质部位总离子流图（见图2）各色谱峰的保留时间和各色谱峰的一级、二级质谱信息，并结合文献数据和对照品图谱，初步推断出14个化合物的结构。

图2 毛诃子鞣质部位总离子流图

2.7 化学计量学分析

2.7.1 聚类分析

以相似度评价所标定的20个共有峰的峰面积为变量，采用IBM SPSS22.0软件对毛诃子鞣质部位进行系统聚类分析。由聚类分析结果可知，毛诃子鞣质部位大致分为3大类，I类包括S3、S4、S6；I类包括S8、S11、S2、S9，S1，S10，S7；III类包括S5，结果见图3。结合相似度评价结果可以发现，相似度评价结果与聚类分析结果较为一致。

2.7.2 主成分分析

以11批毛诃子鞣质部位的20个共有峰的峰面积为变量，使用IBM SPSS 22.0和SIMCA-P+11分析软件进行主成分分析。以主成分的特征根和贡献率作为选择主成分的依据，提取到6个主成分的特征根大于1的主成分，且它们的累积方差贡献率大于91.814%。PCA碎石图可以看出率先提取出来的6个主成分的坡度较为陡峭。说明所提取的6个主成分可以代表毛诃子鞣质部位的质量。6个主成分特征值分别为5.454、4.218、3.308、2.192、1.798、1.392，方差贡献率分别为27.272%、21.091%、16.541%、10.961%、8.990%、6.959%。用SIMCA-P+11分析软件得到PCA得分图，可以看出样品被分为3类，与聚类分析结果一致。结果见图4。

毛诃子鞣质部位主成分分析的公共因子载荷矩阵见表4，每一个载荷量表示主成分与对应变量的相关系数，经计算可得主成分的模型如下：

F1=0.0788x1+0.0069x2+0.1276x3-0.1923x4+0.3344x5+0.2950x6-0.2368x7+0.1118x8+0.2424x9+0.3066x10-0.2616x11+0.2826x12-0.3199x13+0.1396x14+0.0505x15+0.2458x16+0.3259x17+0.1619x18+0.2261x19+0.0625x20

F2=-0.3029x1+0.2274x2+0.3462x3+0.2990x4-0.2094x5-0.0764x6+0.0769x7+0.3725x8+0.0419x9+0.1665x10+0.3287x11+0.2405x12+0.2892x13+0.1568x14+0.0180x15+0.2021x16+0.2103x17+0.1315x18+0.0234x19-0.2147x20

表3 毛诃子鞣质部位化学成分HPLC-MSn数据

图3 11个批次毛诃子鞣质部位聚类分析结果

F3=0.3255x1+0.4014x2+0.1985x3+0.3392x4+0.1820x5+0.2425x6+0.3684x7+0.0737x8+0.0462x9-0.2782x10-0.0247x11+0.0088x12-0.0654x13-0.3057x14-0.1787x15+0.1688x16+0.0203x17-0.1380x18+0.0434x19+0.2936x20

F4=0.0601x1+0.1486x2-0.0027x3-0.0817x4+0.1196x5-0.1702x6+0.0905x7-0.3553x8+0.4208x9-0.1013x10+0.1945x11-0.2864x12+0.0432x13+0.4438x14-0.4242x15+0.1587x16+0.0142x17+0.2796x18-0.0176x19-0.0176x20

图4 主成分分析结果

F5=-0.2506x1+0.1775x2-0.3721x3+0.0336x4-0.0395x5+0.2588x6+0.2297x7+0.0887x8+0.3706x9+0.0895x10+0.1894x11-0.2215x12+0.0552x13-0.0679x14+0.3893x15+0.4020x16-0.1797x17-0.0224x18+0.0328x19+0.2282x20

F6=0.1373x1-0.0907x2+0.0873x3+0.0949x4+0.0865x5-0.0432x6+0.0568x7+0.0687x8-0.0407x9-0.1399x10-0.0127x11-0.0924x12-0.1449x13-0.0322x14+0.3356x15-0.0339x16+0.2229x17+0.5272x18-0.6645x19+0.0627x20

表4 公共因子载荷矩阵结果

图5 PLS-DA结果

F1、F2、F3、F4、F5、F6分别表示6个主成分，其中F1是第一主成分，是“信息量”最多的峰。第一主成分中各色谱峰系数的大小反映了成分贡献率的大小，前5名变量对应的色谱峰分别是：5、17、10、6、12号色谱峰，通过与对照品比对确定10号共有峰为诃子鞣酸，6号共有峰为柯里拉京，12号共有峰为鞣花酸，5、17号共有峰待指认。

2.7.3 偏最小二乘判别分析

采用SIMCA-P+11软件对11批样品色谱数据进行PLS-DA分析，结果见图5。PLS-DA得分图可以看出11批样品被分为3类，与聚类分析和主成分分析结果相一致。PLS-DA还常用于寻找区分不同批次样品的化学成分。在PLS-DA模型中，VIP图可反映出每个峰的贡献程度，并从高到低进行排序。以VIP值大于1.2为标准，1、14、13号峰可能是鉴别毛诃子样品最主要的色谱峰，经指认1号峰为没食子酸。

3 总结与讨论

本实验选择的11批毛诃子鞣质部位的相似度在0.832-0.973之间，只有新疆产地制备的鞣质部位在0.9以下，表明不同产地的毛诃子鞣质部位具有一定的差异性，但大多数具有较好的相似性。与药材相比，鞣质部位的相似度发生变化，可能是由于提取过程中成分的部分水解造成的。

主成分分析得分图和偏最小二乘判别分析得分图均将样品被分为3类，与聚类分析结果较为一致，表明说明聚类分析与主成分分析和偏最小二乘判别分析的结合能对指纹图谱进行更好地识别。本实验指认共有峰中的没食子酸，柯里拉京，鞣花酸等成分，药理实验研究表明这些成分具有良好的抗氧化，护肝活性，与毛诃子的药理活性一致而且含量较高，可作为毛诃子的主要指标成分。

1 国家药典委员会主编.中华人民共和国药典(2015年版).北京:中国医药科技出版社,2015.

2 罗达尚.新修晶珠本草.四川科学技术出版社,2004:471.

3 Guleria S,Tiku A K,Rana S.Antioxidant activity of acetone extract/fractions ofTerminalia bellericaRoxb.fruit.Indian J Biochem Biophys,2010,47(2):110-116.

4 Latha R C R,Daisy P.Insulin-secretagogue,antihyperlipidemic and other protective effects of gallic acid isolated fromTerminalia bellerica,Roxb.in streptozotocin-induced diabetic rats.Chem Biol Interact,2010,189(1-2):112-118.

5 Ali M S,Faruq K O,Islam A,et al.Thrombolytic and Cytotoxic Activities ofTerminalia bellericaRoxb.Bangladesh Pharmaceutical Journal,2015,16(2):131-135.

6 柏宏伟,张小琴,姜奕晨,等.板栗鞣花酸鞣质的提取纯化及抗氧化活性.北京农学院学报,2015,30(4):38-43.

7 赵海娟,龚曼,常青,等.藏药余甘子鞣质部位对HT1080细胞迁移与侵袭能力的影响研究.中国药物警戒,2014,11(5):264-267.

8 姚思宇,赵鹏,刘荣珍,等.鞣质降血脂作用的动物实验研究.中国热带医学,2004,4(6):945-946.

9 沈忠明,殷建伟,袁海波,等.虎杖鞣质的降血糖作用研究.天然产物研究与开发,2004,16(3):220-221.

10陈文静,梁文仪,李师,等.基于指纹图谱分析和多成分同时定量的藏药毛诃子质量评价研究.中草药,2017,48(6):1210-1215.

11 Wei W,Pan Y,ChenY,et al.Carboxylic Acids fromPhyllanthus urinaria.Chem Nat Compd,2005,41(1):17-21.

12 Yang B R,Kortesniemi M,Pengzhan L,et al.Analysis of hydrolyzable tanninsand otherphenolic compoundsin Emblic Leaffower(PhyllanthusembicaL.) Fruit by High Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Mass Spectrometry.J Agric Food Chem,2012,60(35):8672-8683.

13 Fang S H,Rao Y K,Tzeng Y M.Antioxidant and inflammatory mediator's growth inhibitory effects of compounds isolated fromPhyllanthus urinaria.J Ethnopharmacol,2008,116(2):330-340.

14 Liu C S,Tae G N,Han M W,et al.Protective Effect of Detoxified Rhus verniciflua Stokes on Human Keratinocytes of the Bioactive Phenolics.Biosci Biotechnol Biochem,2013,77:1682-1688.

Quality Evaluation of Terminalia billerica(Gaertn.)Roxb.Tannins Fraction from Different Habitats by HPLC Fingerprint Based on HPLC-MSnand Chemometrics

Chen Wenjing,Liang Wenyi,Li Shi,Wu Lingfang,Cui Yaping,Qi Qi,Ye Ting,Liang Linjin,Zhang Lanzhen
(School of Chinese Pharmacology,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102,China)

This paper was aimed to establish the HPLC fingerprint of T.Billerica(Gaertn.)Roxb.tannin fraction.The analysis was performed on Atlantic T3(250 mm × 4.6 mm,5 μm)C18 column.The mobile phase was acetonitrile-0.2%glacial acetic acid aqueous solution with gradient elution.The flow rate was 1.0 mL·min-1.The injection size was 20 μL.The temperature was maintained at 30℃.Eleven batches of T.Billerica(Gaertn.)Roxb.tannin fraction of chromatographic data was analyzed by similarity of chromatographic data,SPSS software and SIMCA software.There were 20 common peaks in the diagram.The similarity analysis of 11 samples revealed that the similarities were between 0.832 and 0.973.Only the similarity of tannin parts from Xinjiang was below 0.9.The cluster analysis classified the tannin parts into 3 types,which shared the similar results as the principal components analysis(PCA).PLS-DA found that peak 1,13 and 14 may be the main chromatographic peaks to identify tannins fraction.The HPLC-MSninformation of 14 compounds in T.billerica(Gaertn.)Roxb.was summarized.It was concluded that chemometrics analysis method can be used to analyze the HPLC fingerprint of T.billerica(Gaertn.)Roxb.tannin fraction.This method was rapid,simple,and reproducible.It can be used as one of the effective methods for the quality control of T.billerica(Gaertn.)Roxb.tannin fraction.

Terminalia billerica(Gaertn)Roxb.,tannin parts,chemometrics,HPLC,fingerprints

10.11842/wst.2017.07.024

R917

A

2017-05-02

修回日期：2017-06-01

＊ 通讯作者：张兰珍，本刊编委，研究员，博士生导师，主要研究方向：中药药效物质基础与质量控制研究。

（责任编辑：陈 宁，责任译审：王 晶）