,,,,*

(1.天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;2.威海海洋职业学院食品工程系,山东威海 264300)

白酒发酵副产物黄水有机成分分析

盛杰1,2,徐亚超1,纪海玉1,刘安军1,*

(1.天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;2.威海海洋职业学院食品工程系,山东威海 264300)

本研究对白酒发酵副产物黄水主要有机成分进行定性和定量分析。首先使用指示剂法检测蛋白质或多肽以及生物碱;其次应用标准曲线法测小分子糖、氨基酸,顶空固相微萃取-气相色谱法检测乙醇含量;最后采用高效液相色谱法测有机酸种类和含量,顶空固相微萃取-气质联用检测挥发性成分。研究发现,黄水中含有氨基酸,不含多肽、蛋白质和生物碱,pH为4.34,乙醇1.04 mL/100 mL,小分子糖含量11.01 mg/mL,氨基酸含量5.11 mg/mL,乙酸737.58 mg/100 mL,甲酸248.73 mg/100 mL,挥发性成分共有56种,其中酯类物质占90.38%。结果表明,白酒发酵副产物黄水的有机成分主要为小分子糖、氨基酸、乙醇、乙酸、甲酸和酯类物质。

白酒,酿酒黄水,有机成分,定性定量分析

酿酒黄水是采用固态法发酵生产浓香类白酒时产生的一种副产物,别名黄浆水[1-2]。浓香类白酒常以高粱、大米、小麦、豆类等作为主要原料,经过加入曲种、送水于池内后进行发酵所得[3-4]。由于原料不同,副产物黄水中主要成分所含种类和含量也会有所不同。酿酒原料在进行发酵过程中,大分子物质如淀粉、糊精,分解后的小分子物质如还原糖、乙醇等,以及微生物菌种等成分均混合于水中,并且经长期在窖池底部沉积,形成黄水[4]。由此得出,黄水中所含物质丰富,大体含淀粉、还原糖、酒精、单宁及色素等,除上述成分外,还存在大量酸类物质,以有机酸为主[5-6],酯类物质也是酿酒黄水中常见的一类物质,其中以脂肪酸乙酯所占比例最多。

目前,在我国很多酒厂都是采用回窖发酵、培养人工窖泥、养窖等方式方法来处理酿酒黄水[7],虽然在一定程度上实现了酿酒黄水的资源化再利用,但没有大范围得到解决,很多酿酒黄水被作为废弃物直接被排放到环境中,造成了黄水资源的浪费,而且对环境造成了严重污染。近年来,基于黄水中含有的丰富营养成分,科研技术人员充分探讨研究黄水在各个领域的用途,以此找出更多新的应用领域来提高酿酒黄水的使用价值。

本文系统分析了白酒发酵副产物黄水可能的主要成分,旨在探寻其发挥主要抑菌作用的成分。前期研究证明:酿酒黄水对常见的致病菌细菌(大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌以及枯草芽孢杆菌)以及根霉菌和青霉菌等部分霉菌都有明显的抑菌性能;同时也证明了黄水的抑菌性能在高温、低温、紫外线照射、高糖、高盐,金属离子等外界条件的干扰下,都表现出较好的抑菌性能;这都为发酵工业副产物黄水的应用提供思路,利用黄水的抑菌性能,可代替部分合成防腐剂作为天然保鲜剂应用于食品中。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

白酒、酿酒黄水 江苏大风歌酒业有限公司;茚三酮、碘化钾、草酸、酒石酸、甲酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、富马酸、琥珀酸、丙酸、95%乙醇、叔丁醇 均为分析纯。

电热恒温水浴锅 上海医疗器械三厂;pHS-25型pH计 上海雷磁仪器厂;SAAB-57324SPME手动萃取头 上海安谱科学仪器有限公司;HP5809气相色谱/质谱计算机联用仪 美国惠普公司;Waters e2695高效液相色谱仪 德国Waters公司;GC9700型气相色谱仪 温岭市福立分析仪器有限公司;氢火焰检测器(FID)。

1.2实验方法

1.2.1 双缩脲定性实验 取黄水1 mL于试管中,先向试管中加入1 mL双缩脲试剂A,摇匀,再向试管中加入2滴双缩脲试剂B,振荡摇匀,观察颜色变化[8]。

1.2.2 茚三酮定性实验 取黄水1 mL于试管中,用滴管加入0.2%茚三酮乙醇试剂2滴,摇匀,沸水浴加热2 min,待颜色稳定后,冷却,观察颜色变化[9]。

1.2.3 碘-碘化钾定性实验 取黄水1 mL于试管中,加入碘-碘化钾试剂,观察试管中颜色变化[10]。

1.2.4 顶空固相微萃取-气相色谱法测乙醇含量 首先,手持萃取头Hub(PDMS-100 μm)一端和手柄接入后将其插入GC进样口进行活化。条件为230 ℃、30 min;色谱柱:石英毛细管柱DB-ALC2 30 m×0.53 mm×2 μm;柱温40 ℃;气化室温度220 ℃;检测器温度220 ℃;解析条件220 ℃,解析时间60 s;用超纯水配置浓度分别为1.25、1.50、1.75、2.00、2.25 mg/mL的一系列乙醇标准溶液;取标准溶液体积5 mL注入15 mL顶空瓶中,按0.15 g/mL加入氯化钠盐析剂,并加入1 mL叔丁醇内标工作液(1000 μg/L),在顶孔瓶内放入搅拌磁子,并且隔垫将口密封,设置萃取温度为50 ℃,平衡时间为5 min,萃取时间为30 min,后立即上样进行气相色谱分析。以乙醇的峰面积作为纵坐标,乙醇的标准溶液浓度作为横坐标,绘制标准曲线;同理,首先量取1 mL黄水于容量瓶中,用重蒸水定容至5 mL,然后转移至15 mL顶空瓶中,加入0.75 g氯化钠盐析剂与1 mL叔丁醇内标工作液(1000 μg/L),放入搅拌磁子后隔垫密封;并放于磁力加热搅拌器上加热搅拌,后将SPME萃取头萃取后的待测试样立即进行气相色谱分析;所有实验均进行3次,标准曲线法进行定量分析[11]。

1.2.5 酸度的测定 样品过滤后,取50 mL于100 mL烧杯,在室温下用pH计多次测量,待稳定后,记录pH;

1.2.6 有机酸含量和种类的测定 色谱柱:Spursil C18(250×4.6 mm×5 μm);检测波长215 nm,流速1 mL/min,进样量20 μL;流动相:准确称取KH2PO44.0827 g,三蒸水溶解后定容至1000 mL容量瓶,磷酸调pH至2.8,经0.45 μm滤膜过滤后于超声波清洗器中脱气30 min备用。标准品配置:分别称以下有机酸,均放于50 mL容量瓶中,三蒸水定容至刻度,按表1配置各有机酸标准溶液和有机酸混合标准溶液,过0.45 μm的微孔纤维素滤膜备用。样品过0.45 μm的微孔纤维素滤膜备用,上机,根据保留时间确定样品中有机酸种类,采用外标定量的方法,计算样品中各物质的含量[12-14]。

表1 标准品的浓度及色谱保留时间Table 1 Concentration and reserved time of normal sample

1.2.7 挥发性成分的测定 色谱条件:色谱柱:DB-5 ms(30 m×0.25 mm×0.25 μm);进样温度:250 ℃;载气:He,99.999%;分流比:20∶1;程序升温:初始温度80 ℃,保持3 min,然后以3 ℃/min升至230 ℃,保持20 min。质谱条件:质量分离器:离子阱;离子源:EI;电离能量:70 eV;离子阱温度:220 ℃;传输线温度:280 ℃;溶剂延长时间:2.5 min;扫描方式:全扫描;扫描范围:50～1000 m/z;萃取头(PDMS-100 μm)的处理:15 mL顶空瓶中装入5 mL酿酒黄水,并封盖,插入固相微萃取装置,萃取温度50 ℃,平衡时间5 min,萃取时间30 min。取出萃取头,直接进样进行GC-MS分析,解析时间10 min,化合物组成的分析以计算机NIST05谱库检索结果和人工谱图解析相结合的方法确定,按面积归一化法进行定量[15-16]。

1.2.8 糖含量的测定 准备8只洗净的试管,分别取0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL标准葡聚糖液,加蒸馏水补齐1 mL,每个试管再加6%苯酚溶液1 mL,加浓硫酸5 mL,混匀,微振,静置10 min,沸水浴中加热15 min后,取出迅速冷却至室温,放置20 min。用紫外分光光度仪在490 nm波长下测定吸光度。空白对照以蒸馏水代替糖溶液,葡聚糖浓度为横坐标,吸光度值A为纵坐标,绘制标准曲线。准确吸取稀释梯度为25的黄水0.1 mL,加蒸馏水0.9 mL,6%苯酚1.0 mL,浓硫酸5.0 mL,同样用苯酚-硫酸法测定样品在490 nm波长下的吸光度,根据标准曲线计算糖含量[17]。总糖含量计算公式:C=N×C1,N为稀释倍数250,C1为标准曲线读数。

1.2.9 氨基酸含量的测定 分别吸取0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 mL氨基酸标准液于25 mL的容量瓶,各加4 mL水、磷酸缓冲液0.5 mL和2%茚三酮标准液体0.5 mL,沸水浴煮沸15 min,冷却后加水定容至25 mL,570 nm下测定吸光光度值。以氨基酸浓度为横坐标,吸光光度值为纵坐标做标准曲线。吸取稀释10倍的酿酒黄水1 mL放置于25 mL容量瓶中,按上面操作步骤测其吸光光度值[18]。氨基酸含量计算公式:C=N×C2,其中,N为稀释倍数10,C2为标准曲线上读数。

1.2.10 数据统计分析 每个样品设三个平行,采用SPSS 20.0和Origin 8.0软件进行数据分析,实验数据采用ANOVA进行邓肯氏差异分析,以p<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1黄水成分定性实验分析

由表2可看出,样品中含氨基酸,不含多肽、蛋白质和生物碱。这与Tan GX[18]白酒发酵副产物黄水中含蛋白质0.08%～0.27%不同,可能由于白酒发酵的原料、原料配比、原料质量、窖龄、窖池质量等因素的不同所致。

表2 酿酒黄水的定性分析实验结果Table 2 The qualitative analysis experimental results ofyellow water from wine fermentations

2.2顶空固相微萃取-气相色谱法测定乙醇含量

图1为部分浓度测试液体的乙醇色谱图,图2为乙醇标准曲线图,经计算样品中乙醇含量为1.04 mL/100 mL,可知,黄水中所含乙醇含量极低。

图1 乙醇的色谱图Fig.1 Chromatograms of ethanol注:曲线1是0.2 g/100 mL乙醇标准品,曲线2是5倍稀释样品,曲线3是0.125 g/100 mL乙醇标准品。

图2 乙醇标准曲线Fig.2 The normal curve of ethanol

2.3酿酒黄水pH的测定及有机酸含量的测定

根据1.2.5实验方法测定酿酒黄水的酸碱度可知,其pH为4.34。这与朱开宪[19]白酒发酵副产物黄水pH为3.85～6.71相吻合,同时也提示我们,在进一步研究抑菌成分时是否与此酸度有直接关系。同时,图3、图4分别为标准混合酸和酿酒黄水的HPLC图,可知样品中主要含草酸,甲酸,乳酸,乙酸和柠檬酸,其乙酸含量最多,为737.58 mg/100 mL,其次为甲酸,其含量为248.73 mg/100 mL。

图3 标准混合酸的HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of standard mixed acid

图4 酿酒黄水的HPLC色谱图Fig.4 HPLC chromatograms of yellow water

有机酸浓度(mg/100mL)保留时间(min)草酸31.335.707甲酸248.737.326乳酸32.029.350乙酸737.5810.177柠檬酸12.5013.058

2.4黄水挥发性成分的测定

图5为酿酒黄水气相色谱图,表4与表5可知样品中主要挥发性成分有56种,其中酯类面积百分比为90.38%,酯类物质的大量存在,使得黄水可以作为香味物质应用于食品中,宋柯等人采用黄水提取香味成分应用于香料中[20]。

图5 酿酒黄水气相色谱图Fig.5 Gas chromatogram of yellowwater from wine fermentation

序号保留时间(min)化合物名称面积百分比(%)12.577二戊醇0.09923.195丙烯醛0.03833.543二戊酮0.01043.967丙酸乙酯0.62554.3163-甲基-3-庚醇0.02564.548三甲基乙烯0.02775.051丁酸乙酯0.00485.399正戊醇0.01095.9412,3-丁二醇0.004106.653丁酸0.863117.9562-甲基丁酸丁酯0.006128.149异戊酸0.055138.4582-甲基丁酸0.051148.6893,4二甲基戊醇0.514159.418甲基戊基酮0.015169.457苯乙烯0.027179.767戊酸乙酯1.2541810.021戊酸0.0151910.676己酸甲酯0.0162012.302异己酸己酯0.0712112.649庚醇0.0222213.744丁酸丁酯66.012315.866己酸丙酯17.522416.550辛醇0.1252516.930对甲基苯酚抑菌性0.2912617.346己酸丙酯0.3502717.454庚酸乙酯0.7392817.667庚酸0.4262918.241苯乙醇0.044

续表

表5 酿酒黄水中主要的挥发性成分(%)Table 5 The main volatile componentsin yellow water from wine fermentation(%)

2.5酿酒黄水小分子糖含量的测定

图6为葡萄糖标准曲线图,经检测样品所含总糖为11.01 mg/mL,这与朱开宪[19]白酒发酵副产物黄水中还原糖含量为6～45 mg/mL相吻合。

图6 葡萄糖标准曲线Fig.6 The normal curve of glucose

2.6酿酒黄水氨基酸含量的测定

图7为氨基酸标准曲线图,计算可知,样品中氨基酸含量为5.11 mg/mL。这与朱开宪[19]白酒发酵副产物黄水中总氮含量为2.7～3.5 mg/mL有所不同,但同时猜测,这与发酵液原料和发酵液储存时间等因素有直接的关系,同时氨基酸添加到酿油中可增加其鲜味,作为防腐剂添加到食品中也增加营养价值。

图7 氨基酸标准曲线Fig.7 Normal curve of ethanol

3 结论

酿酒黄水中成分复杂,其中主要包括糖、蛋白质、氨基酸、有机酸、乙醇、酯等,由于原料等因素不同,成分更是有所差异。本研究综合分析了酿酒黄水的主要成分,研究得出:酿酒黄水pH为4.34,乙醇含量1.04 mL/100 mL,有机酸主要含草酸、甲酸、乳酸、乙酸和柠檬酸,其中乙酸为737.58 mg/100 mL,其次为甲酸,其含量为248.73 mg/100 mL,为黄水中有机酸的应用提供理论依据,例如食醋的生产、有机酸钙的生产等;挥发性成分有56种,其中酯类面积百分比为90.38%,小分子糖含量为11.01 mg/mL,氨基酸含量为5.11 mg/mL,这些有机成分都说明了酿酒黄水有丰富的营养价值,为白酒发酵副产物的广泛应用提供了理论依据。

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Analysisoforganiccomponentsofyellowwaterfromliquorfermentation

SHENGJie1,2,XUYa-chao1,JIHai-yu1,LIUAn-jun1,*

(1.College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China;2.Department of Food Engineering,Weihai Ocean Vocational College,Weihai 264300,China)

In this study,qualitative and quantitative analysis of main organic components of liquor fermentation were made. Firstly,the indicator was used to detect the presence of proteins or peptides and alkaloids and pH was determined by pH meter. Secondly,the standard curve method was used to determine the content of small molecular sugar and amino acid and the ethanol content was determined by headspace solid phase microextraction gas chromatography. Finally,the classification and content of organic acids were determined by HPLC and solid phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry was used to analyze the volatile components. Experiments on the analysis of the components of yellow water from liquor fermentation showed that detection of amino acids,peptides,proteins and alkaloids were not detected,pH was 4.34,the content of ethanol was 1.04 mL/100 mL,the content of small molecule sugar was 11.01 mg/mL,the content of amino acid reached up to 5.11 mg/mL,the content of acetic acid was 737.58 mg/100 mL,the content of acetate formic acid was 248.73 mg/100 mL and a total of 56 kinds of volatile components were contained,the percentage of esters accounted for 90.38% of total volatile constituents. The results showed that small molecular sugar,amino acid,ethanol,acetic acid,formic acid and esters as the organic components were contained yellow water from liquor fermentation.

liquor;yellow water from liquor;organic components;qualitative and quantitative analysis

TS201.2

A

1002-0306(2017)19-0231-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.042

2017-03-29

盛杰(1989-),女,硕士研究生,研究方向:功能性食品的研究与开发,E-mail:270450819@qq.com。

*通讯作者:刘安军(1963-),男,博士,教授,研究方向:功能性食品的研究与开发,E-mail:laj@tust.edu.cn。

省部级农业部项目(201303082-3)。