武士美，靳汝霖，任为一，丹彤，孙天松，孟和毕力格

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特010018）

德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵乳中挥发性风味物质的比较分析

武士美，靳汝霖，任为一，丹彤，孙天松，孟和毕力格

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特010018）

以4株德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）为实验菌株，采用固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术（SPME-GC-MS）相结合的方法，检测4℃贮藏期间发酵乳中的挥发性风味物质，并结合保留指数法对化合物进行有效鉴定，提高化合物的鉴定效率。结果表明，4株德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵乳中的挥发性成分由酸、醛、酮、醇、酯和碳氢化合物等6类化合物组成，主要风味物质中的共有化合物包括乙酸、丁酸、正戊醛、2-戊酮、1-庚醇等物质。其中，IMAU40078发酵乳中还含有乙醛、双乙酰、乙偶姻、乙酸乙烯酯、乙酸乙酯等特征风味化合物，特别是其独有的乙酸乙烯酯、乙酸乙酯等化合物，在保持发酵乳风味的基础上增加了特有的果香味，提升了发酵乳感官品质。本实验研究结果为酸奶发酵剂的筛选提供依据。

SPME-GC-MS；发酵乳；挥发性风味物质

Abstract:In this experiment,four strains of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus were used as experimental strains.The volatile compounds of fermented milk produced by Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus during the storage of 4℃were detected by the combining method of SPME-GC-MS.The analysis method of retention index were used for compound identification.The results showed that volatile compo⁃nents of fermented milk were composed by six compounds,which were acids,aldehydes,ketones,alcohols,esters and hydrocarbon com⁃pounds.The main flavor substances such as acetic acid,butyric acid,pentanal,2-pentanone and 1-heptanol were common compounds.Among them,flavor compounds in the IMAU40078 fermented milk were made up of acetic acid,acetaldehyde,diacetyl,benzoin,acetic acid ethenyl ester and ethyl acetate.These compounds improved the quality of milk.Especially the latter two components,increased the particular fruit fragrance on the basis of keeping the fundamental flavor.This experiment results made a contribution to screening the starter cultures of fermented milk.

Key words:SPME-GC-MS;fermented milk;volatile compounds

0 引言

德氏乳杆菌保加利亚亚种作为发酵剂菌种之一，在酸奶发酵过程中生成的多种挥发性化合物能赋予发酵乳良好的风味[1]。目前已经鉴定出90多种对发酵乳风味形成有重要影响的化合物[2-3]。固相微萃取与气质联用技术（SPME-GC-MS）作为一种高效的检测方法已广泛应用于发酵乳风味物质的分析检测[4-5]。2014年，Pan等[6]人利用SPME-GC-MS结合法检测出戊糖乳杆菌发酵乳中的主要风味物质有乙醇、2-3-丁二酮和乙酸等；2015年，Bao等[7]人用此技术检测出干酪乳杆菌发酵乳中的主要风味化合物有乙酸、丁酸、2，3-丁二酮和己酸乙酯等。本实验分析了4株德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵乳贮藏期间挥发性风味物质的动态变化，为德氏乳杆菌保加利亚亚种在发酵乳中的应用提供借鉴。

1 实 验

1.1 菌种和培养基

1.1.1 菌种

实验所用的4株发酵菌株如表1所示，均由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供。

1.1.2 培养基

表1 菌株编号及对应的Genbank号

脱脂乳培养基（质量分数为10%脱脂乳、0.1%酵母粉）；MRS液体培养基（CM 0359）；全脂复原乳（全脂乳粉11.5%，蔗糖6.5%）。

1.2 仪器设备

气相色谱-质谱联用仪（Agilent，7890B GC sys⁃tem-5977A MSD）；HP-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm ×0.25 μm）；SPME萃取头（50/30 μmDVB/CAR/PDMS）；手动固相微萃取（SPME）进样器。

1.3 方法

1.3.1 发酵乳的制备

将实验室冷冻保藏的上述菌株分别于脱脂乳培养基中活化（37℃，24 h），并分别于50 mL和500 mL的MRS液体培养基中连续传两代（42℃，24 h）后，收集菌体，并加入PBS保护剂制得菌悬液。全脂复原乳预热至60℃搅拌30 min，高压均质2次，95℃巴氏杀菌5 min后，迅速置于冰水中冷却至4℃，按活菌数为5×107mL-1的接种量将菌悬液接种于均质灭菌后的全脂乳中，分装后于42℃培养，待样品pH值低于4.6，滴定酸度到达70～90°T时，在4℃贮藏（此时为0 d），并分别于贮藏期0，1，3，7，14 d取样，利用SPME-GC-MS技术检测分析贮藏期间的风味化合物。

1.3.2 挥发性风味物质测定

色谱条件：采用程序升温方式，起始温度为35℃，保持3 min，然后以4℃/min速率升至140℃，保持1 min，再以10℃/min升至250℃，保持3 min；进样口温度为250℃；载气为He气，流速1.0 mL/min；不分流进样。

质谱条件：电离方式为EI，70 eV；离子源温度为230℃；质量扫描范围m/z 33～450 AMU；发射电流100 μA。

解析附条件：将SPME萃取头插入气相瓶上方萃取60 min，然后在250℃解吸附3 min，不分流进样。

1.3.3 定性与定量分析

利用NIST 11标准库进行质谱检索，并参考已发表的文献资料，鉴定化合物。按照各组分峰面积归一化法计算各组分相对峰面积比（即每种风味物质组分峰面积占离子色谱图中所有风味物质总峰面积的百分比），结合程序升温法计算各组分的保留指数，分析鉴定化合物。

2 结果与分析

本研究以4株具有良好发酵特性的德式乳杆菌保加利亚亚种为实验菌株，采用SPME-GC-MS对发酵乳在贮藏期间风味物质的动态变化进行检测分析，贮藏0 d时的总离子流图如图1所示，结果如表2-表7所示。

图1 贮藏0 d时挥发性风味组分的总离子流图

2.1 酸类化合物的比较

酸类化合物是酸奶中的重要呈味物质，对发酵乳风味的形成有重要影响。由表2可以看出IMAU20298，IMAU40078，IMAU40163，IMAU80319发酵乳中鉴定出的挥发性酸类化合物组成差异不大，其中，检测到的共性物质分别为乙酸、丁酸、3-甲基丁酸、己酸和辛酸等。贮藏0，1，3，7和14 d时，IMAU20298、IMAU 40078、IMAU80319发酵乳中乙酸的相对质量分数最高，其质量分数在IMAU20298发酵乳中依次为6.94%，12%，2.82%，11.14%和13.21%；在IMAU40078发酵乳中依次为3.03%，11.08%，16.26%，14.1%和19.94%；在IMAU80319发酵乳中依次为4.48%，5.02%，7.4%，4.85%和16.54%。任丽等[8]人研究报道乙酸在酸类化合物中占的比例最高，这和本实验研究结果类似。和上述3种发酵乳相比，IMAU40163发酵乳中酸类化合物质量分数分布有较大差异，在贮藏0和1 d时，辛酸的相对含量最高，达到6.51%和5.26%；3、14 d时乙酸质量分数最高，达到7.78%和12.05%；贮藏7 d时3-甲基丁酸的相对质量分数最高，达到13.78%。乙酸、辛酸和3-甲基丁酸等挥发性有机酸，主要产生酸味，对发酵乳的风味贡献较大[8]。Cham⁃mas等[9]人在“Labin”发酵乳中检测到了乙酸、丁酸和己酸等化合物。除上述的5种酸类化合物外，还检测到醋酸酐、庚酸、甲基环己烷羧酸、2-甲基丁酸、戊酸等，尽管这些化合物的相对含量较低，但它们也对发酵乳的风味起着不可忽视的作用。

IMAU20298，IMAU40078，IMAU40163，IMAU80 319发酵乳中挥发性酸类化合物的种类较多，已鉴定的有14种。贮藏期间，酸类化合物的种类和相对质量分数达到峰值的时间点存在明显差异，如IMAU20298、IMAU80319发酵乳中酸类化合物的种类和数量在贮藏14 d时达到峰值，而IMAU40078、IMAU40163发酵乳中酸类化合物的种类和数量分别在贮藏7 d和3 d时达到峰值。这和Güler等[10]人的研究结果较一致。

2.2 醛类化合物的比较分析

乙醛的香味阈值很低，Misselhorn等[11]人检测到乙醛在水中的阈值仅为0.2 mg/kg，低浓度的乙醛能对发酵乳的风味产生较大的影响。我国生产的酸奶主要是以乙醛为主的醛香型酸奶[12]，因此，乙醛质量分数是评估菌株品质的一项重要指标。在上述4株菌株的发酵乳中，IMAU20298发酵乳中乙醛质量分数较高，贮藏期间其相对质量分数分别为10.71%，8.46%，6.74%，8.73%和5.87%；IMAU40078发酵乳在贮藏0，1 d和3 d时能检测到乙醛，而在7 d和14 d时均没有检测到乙醛；IMAU80319发酵乳在贮藏期间没有检测到乙醛。这个结果表明菌株生产乙醛具有特异性，类似的结果在Chaves等人[13]的研究中也有发现。此外，上述产乙醛的3株菌株的发酵乳中检测到的乙醛达到峰值的时间点也存在明显差异，如IMAU20298发酵乳在发酵终点（0 d）时乙醛的相对质量分数达到峰值（10.71%）；IMAU40078和IMAU40163发酵乳在贮藏1 d时达到峰值（4.61%和7.78%）。从上述发酵乳中乙醛质量分数的变化情况分析发现，这些菌株发酵乳中乙醛质量分数均在贮藏初期达到峰值，随后略有下降，可能是因为乙醛作为代谢中间产物，在酶的催化作用下可转化成其他代谢产物。除乙醛外，相对质量分数较高的有正戊醛、3-甲基丁醛和庚醛等。3-甲基丁醛具有麦芽香味[14]，庚醛具有迷人的脂肪香[15]，这些化合物可构成发酵乳风味。

表2 贮藏期间酸类化合物的鉴定结果

2.3 酮类化合物的比较分析

酮类化合物一般呈奶油味或果香味，是构成发酵乳风味的主体之一。其中，代表性的酮类化合物有双乙酰和乙偶姻[16-17]，它们的阈值很低，微量的双乙酰和乙偶姻也会对发酵乳的风味产生影响。从表4可知，IMAU40078发酵乳在贮藏1、3 d时检测到双乙酰，其相对质量分数分别为1.5%和0.8%；在贮藏0，1，3，7，14 d时检测到乙偶姻，其相对质量分数分别为3.32%，6.05%，5.82%，5.68%和7.04%。而在IMAU40163发酵乳中只检测到乙偶姻，其在贮藏期间的相对质量分数分别为3.04%，0.41%，0.29%，0.77%和1.43%。这可能是因为双乙酰很不稳定，在双乙酰还原酶的作用下易被还原成乙偶姻。类似的研究结果在杨天佑等[18]人的研究中也有发现。此外，上述4株发酵乳中都检测到了2-戊酮、2-庚酮、2-壬酮和2-十一烷酮等，这些酮类化合物属于甲基酮类，由多不饱和脂肪酸β-氧化生成，可赋予发酵乳良好的风味[19]。

2.4 醇类化合物的比较分析

发酵乳中的醇类化合物主要由乳酸菌发酵糖类物质产生，醇香与乳香的平衡使发酵乳风味更加丰满。由表5可以看出，IMAU20298，IMAU40078，IMAU40163，IMAU80319发酵乳中检测到9种醇类化合物；其中，IMAU40078发酵乳中(S)-1，3-丁二醇的相对质量分数较高，贮藏期间其相对质量分数依次为1.4%，2.55%，4.7%，3.04%和1.99%。其他检测到的低分子醇类化合物有1-庚醇、1-辛醇和2-壬醇等，这些化合物的相对质量分数的分布差异不大，如IMAU20298发酵乳中1-庚醇的相对质量分数的变化范围在0.61%至0.77%之间；而IMAU40078发酵乳中1-庚醇的相对质量分数的变化范围在0.28%至0.47%之间。研究认为，这些风味是发酵乳中重要的风味影响成分，如1-庚醇、1-辛醇具有果香和花香味，2-壬醇具有清新的果香味，3-甲基丁醇具有麦芽香味[20-21]。

2.5 酯类化合物的比较分析

酯类化合物能让发酵乳呈现迷人的香味，可以有效减弱脂肪酸和胺类产生的苦味[22]。在IMAU20298，IMAU40078，IMAU40163，IMAU80319发酵乳中已鉴定的酯类化合物种类较少；其中，IMAU20298发酵乳中检测到甲酸乙烯酯、醋酸甲酯、δ-壬内酯等3种；IMAU40078发酵乳检测到乙酸乙烯酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯等3种；IMAU40163发酵乳中只检测到了δ-壬内酯；IMAU80319发酵乳中检测到了甲酸乙烯酯、1-甲氧基-2-丙基乙烯酯、乙酰乙酸壬酯等3种。在上述化合物中，只有甲酸乙烯酯、乙酸乙烯酯和乙酸乙酯等化合物的相对质量分数较高，其中，IMAU20298发酵乳在贮藏期间检测到甲酸乙烯酯的相对质量分数为 26.24%，19.95%，14%，18.19%和 12.15%；IMAU40078发酵乳中检测到乙酸乙烯酯的相对质量分数为2.07%，2.57%，3.39%，4.87%和4.74%；检测到乙酸乙酯的相对质量分数为2.63%，2.01%，1.54%和0.97%。乙酸乙烯酯和丁酸乙酯能使发酵乳产生果香味，对发酵乳的风味有较大的贡献[23-24]。IMAU20298发酵乳与IMAU40163发酵乳在贮藏0 d时都检测到了δ-壬内酯，δ-壬内酯有坚果味与甜味[25]，δ-壬内酯的风味阈值较低，在较低的质量分数下，可赋予发酵乳较好的风味。

表3 贮藏期间醛类化合物的鉴定结果

表4 贮藏期间酮类化合物的鉴定结果

表5 贮藏期间醇类化合物的鉴定结果

（续表5）

表6 贮藏期间酯类化合物的鉴定结果

表 7 贮藏期间碳氢化合物的鉴定结果

2.6 碳氢化合物的比较分析

由表 7可以看出，IMAU20298，IMAU40078，IMAU40163，IMAU80319发酵乳中已鉴定的挥发性碳氢化合物有3，3-二甲基-1-丁烯、正庚烷、甘菊环烃和2，6，11-三甲基十二烷等4种。其中，IMAU40078发酵乳中正庚烷的相对质量分数较高，在贮藏1 d和3d时其相对质量分数分别为0.74%和2.73%。其他3种化合物的相对质量分数较低，可能对发酵乳风味的影响不大。

3 结论

本研究采用SPME-GC-MS相结合的方法检测IMAU20298，IMAU40078，IMAU40163，IMAU80319发酵乳中的挥发性风味化合物；共鉴定酸类、醛类、酮类、醇类、酯类和碳氢化合物等6类化合物。4种发酵乳比较，IMAU40078发酵乳中含有乙酸、乙醛、双乙酰、乙偶姻、乙酸乙烯酯、乙酸乙酯等特征风味物质，且质量分数较高，说明IMAU40078发酵乳风味优于其他3种菌株发酵乳。这项研究为德式乳杆菌保加利亚亚种作为发酵剂在发酵乳风味方向的应用提供借鉴。

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Comparision and analysis of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus on producing volatile compounds in fermented milk

WU Shimei,JIN Rulin,REN Weiyi,DAN Tong,SUN Tiansong,Menghebilige
（Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China）

Q93-33

A

1001-2230（2017）09-0004-07

2016-12-20

国家自然科学基金项目（31471711;31460446）。

武士美（1992-），女，硕士研究生，研究方向为乳品微生物与生物技术。

孟和毕力格