蒋欣容，瞿恒贤，陈大卫，陈霞，黄玉军，印伯星，杨振泉，顾瑞霞

（扬州大学江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室，江苏扬州225127）

乳酸菌混合发酵对抑菌作用的影响研究

蒋欣容，瞿恒贤，陈大卫，陈霞，黄玉军，印伯星，杨振泉，顾瑞霞

（扬州大学江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室，江苏扬州225127）

通过测定6株乳酸菌及其混合发酵对3种革兰氏阳性菌和3种革兰氏阴性菌抑制作用，探究单一发酵及混合发酵对抑菌作用的影响。结果显示，6株不同乳酸菌及其混合发酵对3种革兰氏阳性菌和3种革兰氏阴性菌的抑制效果均不同。建立主成分分析模型，根据模型中累计贡献率达75.284%两个主成分，进行综合评分，可得乳酸菌混合发酵抑菌效果高于任一单菌株发酵，乳酸菌混合发酵表现出广谱抑菌性。通过排除乳酸及过氧化氢干扰，以及经pH 6.0处理、121℃，20 min热处理、蛋白酶K处理，进一步对乳酸菌及其混合发酵抑菌物质分析，可知除乳酸外，不同乳酸菌及其混合发酵的发酵产物中存在其他抑菌物质，且抑菌产物中过氧化氢浓度不足以产生抑菌效果。乳酸菌发酵抑菌物质在酸性条件下活性高，对热和蛋白质酶K敏感。

乳酸菌；混合发酵；广谱抑菌；抑菌成分；主成分分析

Abstract:The antibacterial effect of single fermentation and mixed fermentation were studied by measuring the inhibitory ability of 6 strains of Lactic acid bacteria and their mixed fermentation on three Gram-positive bacteria and three Gram-negative bacteria.Test results revealed,6 strains of Lactic acid bacteria and their mixed fermentation had different effects on three Gram-positive bacteria and three Gram-negative bac⁃teria.Based on the cumulative contribution rate of 75.284%in the principal component analysis model,we can see that the antibacterial effect of mixed fermentation of Lactic acid bacteria was higher than any single strain.Mixed fermentation by 6 strains had a broad antibacterial spec⁃trum.Exclusion the organic acids and hydrogen peroxide,we has further analyzed antibacterial active ingredients of single fermentation and mixed fermentation by 6 strains at pH 6.0,in 121°C for 15 min or treated by Proteinase K.We found that there were some antimicrobial substances in the fermentation product without lactic acid.The concentration of hydrogen peroxide in antimicrobial substances was not enough to produce antibacterial effect.The antibacterial substances had favorable stability in acid condition.And the antibacterial substances made by mixed fermentation have been sensitive to heat and protein enzyme K.

Key words:Lactic acid bacteria;mixed fermentation;wide antimicrobial properties;antibacterial ingredients;principal component analysis

0 引言

乳酸菌具有维持肠道正常菌群平衡[1-2]，抑制病原菌繁殖，防止有害物质产生[3-5]，延缓衰老、降胆固醇、增强免疫力等多种功能特性[6]，被广泛运用到食品、医药相关领域[7-8]。而单菌株抑菌活性及范围，因各自代谢产物不同造成明显差异，使其应用受到限制[9-10]。近年来，随着医学、现代营养学及肠道保健理论的发展，筛选具有特定功能特性的益生菌，及其发酵制品开发，在全世界引起了广泛研究[11-12]。但对于如何利用多菌株进行发酵，提高发酵产品的广谱抑菌特性，并综合提高对宿主健康的有益作用，尚需进行深入研究。本文利用实验室筛选获得的具有良好抑菌特性的6株乳酸菌，探索混合发酵对体外抑菌特性的影响，以期为混合乳酸菌功能发酵产品的开发提供帮助。

1 实 验

1.1 培养基制备

酶解脱脂乳培养基[14]：12%(w/v)的脱脂乳溶液，115℃，20 min灭菌，冷却后添加质量浓度为0.5 g/L的中性蛋白酶，42℃恒温水解2 h，92℃，30 min灭酶，冷却备用。

LB液体培养基、PDA液体培养基、RCM液体培养基（购于广东环凯微生物科技有限公司），取30.0 g培养基粉溶于1 000 mL蒸馏水，121℃，15 min灭菌备用。

固体培养基在相应的液体培养基中加入质量分数为1.0%琼脂粉。

1.2 指试菌制备

大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，假单胞菌，艰难梭菌，枯草杆菌，汉逊德巴利酵母菌，黄曲霉菌均为扬州大学江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室保藏提供。

大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌、假单胞菌、枯草杆菌原菌种分别接种于LB液体培养基，汉逊德巴利酵母菌、黄曲霉原菌种分别接种于PDA液体培养基，艰难梭菌原菌种接种于RCM液体培养基，37℃培养24 h，并用无菌生理盐水调节菌悬液至107mL-1。

1.3 乳酸菌上清液制备

嗜酸乳杆菌（Lactobacillus cidophilus）ss，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）s7，鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）grx19，干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）g9，双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）BLC和嗜热链球菌（Strep⁃tococcus.thermophiles）90-57，均由江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室分离保藏。

将6株乳酸菌及其混合乳酸菌，按照4%接种量，分别接种于脱脂乳酶解培养基中，37℃发酵12 h，取发酵菌液，于Legend mach高速冷冻离心机4 500 r/min离心20 min，经0.22 μm微孔滤膜过滤，收集滤液为乳酸菌代谢上清液。

1.4 乳酸菌上清液抑菌性能分析

1.4.1 抑菌活性测定

采用双层琼脂扩散打孔法[15]，进行抑菌测定。以灭菌MRS液体培养基为空白对照，37℃培养12 h后观察有无抑菌圈形成，并测量其抑菌直径。

1.4.2 乳酸、过氧化氢排除

用乳酸调节与乳酸菌上清液相同pH的MRS液体培养基作为排除乳酸干扰的对照。加入接有指示菌的培养基孔内，用琼脂扩散打孔法测定其抑菌效果，取3次平行测定的平均值。

在过氧化氢酶最适pH值条件下以质量浓度为1 g/L过氧化氢酶处理乳酸菌上清液，37℃水浴1 h，处理后将上清液调至原pH值，作为排除过氧化氢干扰的对照。加入接有指示菌的培养基孔内，用琼脂扩散打孔法测定其抑菌效果，取3次平行测定的平均值。

1.4.3 pH值处理

用氢氧化钠溶液调节乳酸菌上清液pH为pH 6.0，加入接有指示菌的培养基孔内，以未调节pH值的乳酸菌上清液为对照，用琼脂扩散打孔法测定抑菌活性，取3次平行测定的平均值。

1.4.4 热处理

乳酸菌上清液经121℃水浴处理20 min，加入接有指示菌的培养基孔内，以未调节pH值的乳酸菌上清液为对照，用琼脂扩散打孔法测定抑菌活性，取3次平行测定的平均值。

1.4.5 酶处理

在最适pH值条件下以质量浓度为1 g/L蛋白酶K处理供试样品，37℃水浴1 h，处理后将样品调至原pH值，加入接有指示菌的培养基孔内，以未调节pH值的乳酸菌上清液为对照，用琼脂扩散打孔法测定抑菌活性，取3次平行测定的平均值。

1.5 数据统计与分析

采用SPSS20.0软件进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌及其混合发酵对革兰氏阳性菌抑制作用

6株乳酸菌及其1∶1∶1∶1∶1∶1混合后，按4%接种于酶解脱脂乳培养基，在37℃下发酵12 h的样品，经离心过滤处理，取上清液，对革兰氏阳性菌抑制作用如图1所示。

图1 乳酸菌及其混合发酵对革兰氏阳性菌抑制作用

由图1可以看出，不同乳酸菌及其混合发酵上清液对金黄葡萄球菌、枯草杆菌、艰难梭菌三种革兰氏阳性菌抑制作用存在差异，任一单菌株均对其中1种或2种革兰氏阳性菌有抑制作用，而混合菌株发酵都表现出对3种革兰氏阳性菌的广谱抑菌性作用。

2.2 乳酸菌及其混合发酵对革兰氏阴性菌抑制作用

6株乳酸菌及其1∶1∶1∶1∶1∶1混合后，按4%接种于酶解脱脂乳培养基，在37℃下发酵12 h的样品，经离心过滤处理，取上清液，对3种革兰氏阴性菌抑制作用如图2所示。

图2 乳酸菌及其混合发酵对革兰氏阴性菌抑制作用

由图2可以看出，混合菌株发酵上清液对3种革兰氏阴性菌均有较好抑制作用，抑菌圈直径均大于21 mm。除90-57菌株对3种革兰氏阴性菌抑菌效果较弱外，其余5株乳酸菌对3种革兰氏阴性菌也具有一定的抑制作用，但不同单菌株对3种革兰氏阴性菌的抑菌效果存在较大区别。

2.3 乳酸菌及其混合发酵抑菌性主成分分析

混合菌株发酵表现对金黄葡萄球菌、艰难梭菌最强的抑制效果，对枯草杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、假单胞菌抑制效果均介于单菌株发酵最大值与最小值之间。就对6项研究指标来看，利用主成分分析法对乳酸菌及其混合发酵的抑菌效果的综合评分进行评价。按主成分分析法中特征值大于或等于1的原则提取2个主成分，结果如表1所示。由表1可以看出，第1主成分特征值为3.332，占特征值总和的55.54%，第2主成分特征值为1.185，占特征值总和的19.743%，二者特征值均大于1，且累计贡献率为75.284%，故提取这两个主成分就能够比较好的解释乳酸菌及其混合发酵不同抑菌效果。

表1 主成分提取结果及成分得分系数

表2 主成分贡献率

由公式：综合因子得分(F)=各成分得分×对应权重之和(成分得分=成分得分系数与原始变量标准化值乘积之和)。采用主成分分析法获得成分得分系数，由表2成分得分系数矩阵，得出综合得分排名，如表3所示。

表3 综合因子得分

由表3可以看出，乳酸菌及其混合发酵综合评分（F）进行比较：混合菌株＞g9＞BLC＞s7＞grx19＞ss＞90-57。混合菌株发酵F值，高于任一单菌株发酵。主成分分析表明，对3种革兰氏阳性菌和3种革兰氏阴性菌的抑菌效果而言，混合菌株发酵均高于任一单菌株发酵。可能菌株混合发酵条件下，通过各自的代谢活动而有利于各方或偏利于一方，提高代谢产物的产量或增加种类，从而扩大抑菌范围，提升抑菌效果。

2.4 乳酸菌及其混合发酵抑菌性成分

2.4.1 乳酸排除

用乳酸调节与不同乳酸菌及其混合发酵上清液相同pH的MRS液体培养基作为乳酸排除组，并以原发酵上清液作为对照，排除乳酸对3种革兰氏阳性菌和3种革兰氏阴性菌抑菌性的干扰，结果如图3所示。

图3 乳酸对乳酸菌抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的影响

不同乳酸菌及其混合发酵上清液的乳酸排除组，对3种革兰氏阳性菌和3种革兰氏阴性菌抑菌水平均明显低于原发酵上清液的抑菌水平。此结果说明，不同乳酸菌及其混合发酵上清液中，除乳酸外还存在其他的代谢产物，对3种革兰氏阳性菌和3种革兰氏阴性菌具有抑制作用。

2.4.2 过氧化氢排除

以过氧化氢酶处理不同乳酸菌及其混合发酵上清液作为过氧化氢排除组，并以原发酵上清液作为对照，排除过氧化氢对3株革兰氏阳性菌和3株革兰氏阴性菌抑菌性的干扰，结果如图4所示。

不同乳酸菌及其混合发酵上清液，经过氧化氢酶处理后，对3种革兰氏阳性菌和3种革兰氏阴性菌抑菌效果略低于原发酵上清液，可见过氧化氢并不是主要抑菌物质。在排除过氧化氢干扰后，乳酸菌混合发酵组对3种革兰氏阳性菌和3种革兰氏阴性菌抑菌效果均略微降低，并无显著性影响。可能相比于单菌株发酵，混合菌株发酵过程中不产过氧化氢或产过氧化氢含量较少不能产生抑菌效果。

2.4.3 pH调节对抑菌活性影响

以原发酵上清液作为对照，调节不同乳酸菌及其混合发酵上清液pH为6.0，研究pH对发酵上清液抑制3株革兰氏阳性菌和3株革兰氏阴性菌效果的影响，结果如图5所示。

当调节不同乳酸菌及其混合发酵上清液pH值至6时，其对3种革兰氏阳性菌和3种革兰氏阴性菌抑菌水平均明显低于原发酵上清液的抑菌水平，可见在较高pH值水平下，不利于乳酸菌代谢产物发挥抑菌作用。

2.4.4 热处理对抑制活性影响

不同乳酸菌及其混合发酵上清液经121℃水浴处理20 min，并以原发酵上清液作为对照，研究热处理对发酵上清液抑制3株革兰氏阳性菌和3株革兰氏阴性菌效果的影响，结果如图6所示。

不同乳酸菌及其混合发酵上清液经121℃,20 min热处理后，其对3种革兰氏阳性菌和3种革兰氏阴性菌抑菌水平低于原上清液抑菌水平。且不同于上述部分乳酸菌单独发酵，混合发酵上清液经热处理后，抑菌水平下降显著，可能在混合发酵过程中，产生对热敏感的抑菌物质多于乳酸菌单独发酵。

2.4.5 酶处理对抑制活性影响

用蛋白酶K处理不同乳酸菌及其混合发酵上清液，并以原发酵上清液作为对照，研究酶处理对发酵上清液抑制3株革兰氏阳性菌和3株革兰氏阴性菌效果的影响，结果如图7所示。

乳酸菌混合发酵上清液经蛋白酶K处理后，其对3种革兰氏阳性菌和3种革兰氏阴性菌的抑菌水平低于原发酵上清液抑菌水平，相比于大部分单菌株发酵组，变化显著，可能在混合发酵过程中，菌株协同代谢产生对蛋白质酶敏感的抑菌物质。

3 结 论

本文研究了6株乳酸菌及其混合发酵对3种革兰氏阳性菌和3种革兰氏阴性菌抑制作用。乳酸菌混合发酵上清液对3种革兰氏阳性菌，3种革兰氏阴性菌均有抑制作用，乳酸菌混合发酵抑菌谱较宽，比6株不同乳酸菌发酵抑菌范围明显增大。主成分分析表明，乳酸菌混合发酵抑菌效果综合评分均高于单菌株发酵。

图4 过氧化氢对乳酸菌抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的影响

图5 pH值对乳酸菌抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的影响

图6 热处理对乳酸菌抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的影响

进一步对乳酸菌抑菌有效成分分析，除乳酸外，不同乳酸菌及其混合发酵的发酵产物中存在其他抑菌物质。经过氧化氢酶处理后，不同于部分单一乳酸菌发酵组，乳酸菌混合发酵上清液的抑菌活性无显著性变化，推测混合乳酸菌发酵产生的抑菌物质中无过氧化氢，或者其所含的过氧化氢浓度不足以产生抑菌效果。经调节不同乳酸菌及其混合乳酸菌发酵上清液pH至6时，抑菌效果作用显著降低，说明主要的抑菌物质需要在较低pH值协同作用下，才能发挥良好的抑菌效果。经121℃，20 min热处理和蛋白酶K处理后，乳酸菌混合发酵上清液抑菌效果均低于原发酵上清液，变化显著，这不同于部分乳酸菌，可能在混合发酵过程中，菌株协同代谢产生对热和蛋白质酶敏感的抑菌物质，增强了混合发酵菌株抑菌的广谱性及抑菌效果。

图7 酶处理对乳酸菌抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的影响

本研究结果表明，6株乳酸菌进行混合发酵，对综合抑菌效果的发挥具有十分重要的贡献，为混合多菌株乳酸菌功能发酵产品的开发提供帮助。

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Study on bacteriostatic activity of mixed cultivation of Lactic acid bacteria

JIANG Xinrong,QU Hengxian,CHEN Dawei,CHEN Xia,HUANG Yujun,YIN Boxing,YANG Zhenquan,GU Ruixia
(The Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Safety Control,Yangzhou University,Yangzhou 225127,China)

Q939.11+7

A

1001-2230（2017）09-0011-06

2017-01-13

国家自然科学基金（31571855）；“十二五”国家科技支撑计划项目（2013BAD18B12）；江苏省高校自然科学研究重大项目（12KJA550003）；江苏省科技支撑计划课题项目（BY2014 117-04）。

蒋欣容（1991-），女，硕士研究生，研究方向为乳品科学研究。

顾瑞霞