陈志　申才良

摘要：目的 通过比较由单独神经干细胞（NSCs）移植治疗大鼠脊髓损伤（SCI）和由骨髓间充质干细胞（BMSCs）与NSCs序贯治疗大鼠SCI的脊髓恢复情况不同，研究BMSCs对大鼠脊髓微环境的影响以及序贯治疗的可行性和优势。方法 体外分离，培养，纯化NSCs和BMSCs，改良Allen法制造大鼠脊髓损伤（SCI）模型，48只大鼠随机分为单独标记神经干细胞移植组（A组，n=24），间充质干细胞+标记神经干细胞序贯移植组（B组，n=24）。分别于移植后3 d、1 w、2 w，3 w、4 w、6 w、8 w取脊髓组织，观察脊髓空洞形成情况，神经干细胞分化生长情况，以及脊髓胶质疤痕大小。结果 序贯移植组BBB评分比单独神经干细胞移植组高（P<0.05）；观察大鼠在治疗后1，2，3，4，6，8 w时的神经元细胞数目，血管生长情况，胶质疤痕以及脊髓空洞大小A，B组之间有显著性差异（P≤0.05）。结论 BMSCs可促进了NSCs的有效分化，减少胶质化倾向，改善了脊髓的微环境有利于治疗SCI，骨髓间充质干细胞与神经干细胞序贯移植对大鼠脊髓损伤的疗效优于单独移植神经干细胞。

关键词：脊髓损伤；细胞培养；移植；慢病毒转染；序贯移植

中图分类号：R651.2 文献标识码：A 文章编号：1006-1959（2017）20-0038-05

Abstract：Objective To compare by separate neural stem cells（NSCs）transplantation for the treatment of spinal cord injury（SCI）and bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）and NSCs sequential therapy of SCI rats spinal cord recovery，effects of BMSCs on rat spinal cord microenvironment and sequential treatment of culture method of feasibility and advantage.Methods In vitro，separation，purification of NSCs and BMSCs in rats with spinal cord injury，manufacturing method of modified Allen（SCI）model，48 rats were randomly divided into separate labeled neural stem cells transplantation group（group A，n=24），Mesenchymal stem cells+labeled neural stem cells in the sequential transplantation group （group B，n=24）.The spinal cord tissue was observed at 3 d，1 w，2 w，3 w，4 w，6 w and 8 w after transplantation.The formation of spinal cord formation， the growth of neural stem cells and the size of glial scar were observed.Results The BBB score of the sequential transplantation group was higher than that of the neural stem cell transplantation group（P<0.05）.The number of neuronal cells，the growth of the blood vessels were observed at 1，2，3，4，6 and 8 w after treatment.There was a significant difference between the quality scar and the size of the syringia in group A and B（P≤0.05）.Conclusion BMSCs can promote the differentiation of NSCs effectively，reduce glial tendency，improve the micro environment of the spinal cord is conducive to the treatment of SCI，bone marrow mesenchymal stem cells and neural stem cells transplantation on curative effect is better than that of sequential injury of rat spinal cord neural stem cells transplantation alone.

Key words：Spinal cord injury；Cell culture；Transplantation；Lentivirus transfection；Sequential transplantation

脊髓損伤（spinal cord injury，SCI）可导致严重的运动、感觉和自主神经功能障碍，它是一种高花费、高致残率的疾病，目前，对受伤的脊髓还没有有效的治疗方法[1]。脊髓损伤的治疗一直是骨科医生的研究热点和重点，然而手术只能解除对脊髓的压迫和恢复脊柱的稳定性，还无法使损伤的脊髓恢复功能[2]，而应用SCs的多向分化潜能，可生成各种组织细胞，特别是特定的神经细胞，这使得修复损伤的脊髓组织，恢复脊髓功能成为可能，应用SCs移植有可能治愈SCI，是最具潜力的治疗方法。近年来多项研究已经发现神经干细胞和骨髓间充质干细胞局部移植均可促进脊髓损伤的修复[3-4]，但深入研究发现：移植的NSCs在体内存活较少，且即使存活分化也存在困难，原因是脊髓损伤后微环境不利于NSCs的存活，定植及分化。在2013年，Forostyak提出了间充质干细胞能改善脊髓损伤的微环境[5]。同时我们体外实验发现：MSCs促进了NSCs的有效分化[6-7]。那么，其在体内是否显示同样的效应？为了探明在动物体内间充质干细胞是否对脊髓微环境起改善作用以及间充质干细胞对神经干细胞分化的影响，探索序贯移植的有效性及其方法，我们利用大鼠的脊髓损伤模型分别进行了序贯移植与单独神经干细胞移植治疗大鼠SCI的动物实验。endprint

1 材料与方法

1.1实验材料

实验所用SPF大鼠均由安徽医科大学动物实验中心提供，4 w雌性大鼠5只，SPF级，重（100 ±10）g；新生大鼠5只，SPF级；成年雌性大鼠48只，SPF级，重（230±20）g。主要试剂与仪器：胎牛血清FBS（美国Gibco公司）；慢病毒载体（上海吉凯基因公司）；B-27（美国Invitrogen公司）；CO2恒温培养箱（日本三洋）。

1.2实验方法

1.2.1 大鼠NSCs的培养、转染、鉴定 新生SPF级大鼠腹腔麻醉（10%水合氯醛），剪刀离断头颅，75%酒精浸泡5 min，紫外线照射30 min，取大鼠全脑，Hank's液漂洗三次，剪碎全脑，加入神经元基础培养基5 ml，加入胰酶细胞消化液1 ml，消化5 min，加入10%胎牛血清培养基终止消化；70 μm孔径的筛网过滤，制成单细胞悬液，1000 r/min离心10 min，弃上清液， 反复吹打单细胞悬液，加入2 ml无血清培养基 （含有 DMEM/F-12 + 2 %B-27 + 20 ng/mlEGF + 20 ng/mlbFGF + 青霉素100 U/ml + 链霉素0.1 mg/ml），1000 r/min离心3 min，弃上清液， 加入无血清培养基，吹打单细胞悬液，计数。将单细胞悬液以1×106/ ml接种于25 cm2培养瓶中，恒温培养箱（37 ℃、5%CO2）培养， 每3 d换液1次。2～3 d后镜下观察，可见悬浮生长的细胞球，7 d后，600 r/min离心5 min，吸弃上清液，加入新鲜培养基，长颈吸管反复吹打细胞球，制成单细胞悬液，分别接种到两个新培养瓶中，1×105个细胞/瓶，培养条件不变。每3 d换液1次，每7 d传代1次。提取2瓶传代培养三代的NSCs，分别倒入两只25 ml试管中，3000 r/min离心5 min，吸弃上清液，将细胞沉淀接种于6孔板上（接种体积2 ml+病毒量160 μl+ENi.S.液160 μl）。经转染后的神经干细胞继续置入37 ℃、5 %CO2恒温培养箱中培养，，每3 d换液1次。神经干细胞培养7 d后镜下观察转染后神经干细胞的分化情况。

1.2.2 大鼠BMSCs的培养与鉴定 取4 w左右SPF级大鼠的双侧下肢骨，打开骨髓腔，10 ml培养液（含1万U肝素）冲洗，加入3 ml Ficoll-Paque分离液，梯度离心，吸取中间界面层，PBS液冲洗3次，制成单细胞悬液，接种于aMEM培养基（含有10%FBS，100 U/ml青霉素，100 mg/ml链霉素），置于恒温培养箱（37 ℃、5 %CO2），每3 d换液1次，去除未贴壁细胞，至细胞融合时胰蛋白酶消化收集，传代并检测CD29，CD34，CD90。

1.2.3 大鼠SCI模型的创建、分组及序贯移植治疗 实验所用器械、场地均由安徽医科大学动物实验中心提供，取250 g左右的SPF级大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，暴露胸9脊髓（见图1），采用改良的Allen装置制作大鼠脊髓损伤模型。脊髓损伤局部明胶海绵填塞止血，常规肌肉、筋膜、表皮3层缝合。术后3 d每天予青霉素（50000 U/Kg）在大腿处肌注。每6 h人工辅助排小便1次直至恢复自主排便。将48只脊髓损伤大鼠随机分配为对照组和实验组，每组各24只，分笼饲养，实验大鼠出现死亡后以同样标准再次建模递补。序贯移植治疗：对照组（标记神经干细胞移植组，A组，24只）：T9脊髓损伤后3 d经尾静脉注射含单细胞浓度为1×106/ml的POLY-M慢病毒转染后的NSCs条件培养液2 ml；实验组（序贯移植组，B组，24只）：T9脊髓损伤后1 d经尾静脉注射含单细胞浓度为1×106/ml的BMSCs条件培养液1ml，脊髓损伤后3d经尾静脉注射含单细胞浓度为2×106/ml的POLY-M慢病毒转染后的NSCs条件培养液1 ml。

1.2.4 大鼠神经功能评价 由本课题组两名熟悉BBB标准得分的研究生对A、B 两组大鼠进行BBB评分：将大鼠放入一开口大盆，轻敲盆壁使它爬行，观察它的臀部、后肢关节、爪的置放在行走时与躯干的关系情况。术前3 d，每天早晨9点将大鼠放入大盆中，使其熟悉环境。在术后24 h、72 h、1 w、2 w、3 w、4 w、6 w、8 w时每日晨9点分别对A、B 组进行盲法评分（两位观察者未参与建模，两组大鼠观察前后由实验者抓取），每只需观察5 min，由实验者记录评分。

1.2.5大鼠脊髓标本制备和组织学检测 分别于移植后1 w，3 w，6 w，8 w处死大鼠，用10%福尔马林进行灌注固定，以T9脊髓损伤处为中心取长2 cm脊髓，连续20 μm厚度纵切SCI处脊髓标本，行苏木精-伊红（HE）染色和MAP-2、GFAP、RECA免疫荧光染色，观察脊髓空洞形成情况，神经干细胞分化生长情况，以及脊髓胶质疤痕大小。

1.2.6 计算脊髓空洞体积 在移植后6 w处死大鼠，经灌注法获得 A、B组脊髓标本， 制成石蜡切片张切片脊髓空洞的面积，计算出每个标本损伤区中心的脊髓空洞体积。

1.2.7 免疫组化染色和光密度分析 将A、B组的脊髓切片60 ℃烘烤60 min；二甲苯浸泡10 min，更换二甲苯浸泡10 min；分别用无水、95%、85%、70%乙醇浸泡5 min；PBS浸泡5 min，清洗3次；将切片放入耐高温塑料染色架，再将耐高温塑料染色架放入烧杯中，加入抗原修复缓冲液，高火煮沸，保持微沸状态20 min，而后将装有玻片的烧杯浸入流水中，自然冷却；PBS浸泡5 min，清洗3次；3%H2O2-甲醇溶液浸泡15 min；PBS浸泡5min，清洗3次；加入一抗 100 μl，37 ℃，湿盒孵育2 h；PBS浸泡5 min，清洗3次；加入增強剂50 μl，37 ℃湿盒孵育20 min；加入酶标二抗50 μl， 37 ℃湿盒孵育20 min；PBS浸泡5 min，清洗5次；每张片子加2滴新鲜配制的DAB溶液；镜下观察染色深浅，染好立即中止，用自来水轻柔冲洗15 min用蒸馏水终止显色反应；苏木素染液染色。分别用70%、85%、95%、无水乙醇各浸泡5 min。两次二甲苯浸泡，各10 min。晾干后在切片上加中性树胶，加盖玻片。应用美国Media Cybernetics 公司专业图片分析软件Image-Pro Plus 6.0分别对A、B组切片进行免疫组化光密度分析 。endprint

1.3统计学处理

本实验所得数据均采用SPSS 19软件进行统计分析，数据以（x±s）表示，多组均数之间比较采用方差分析，两组均数间比较行t检验，结果以（P≤0.05） 为差异有显著性意义。

2结果

2.1 NSCs的形态观察及鉴定

原代NSCs细胞接种3 d后镜下观察：可见NSCs呈多个悬浮细胞团，到第7 d时培养瓶内可见球状的细胞集落，生长数目达数十甚至上百个， 细胞团状似桑葚，有较强折光性，少数细胞贴壁，未见明显细胞突起形成，见图2。将培养7 d的悬浮NSCs进行慢病毒转染实验，确定神经干细胞最佳的MOI值为10，见图3。

2.2大鼠行为学评价结果

脊髓损伤3 d内，两组大鼠的BBB评分都较低差异没有统计学意义，自大鼠脊髓损伤1 w后，间充质干细胞与神经干细胞序贯移植处理的实验组大鼠BBB评分高于神经干细胞静脉移植处理的对照组，差异有统计学意义（t=-5.818， P=0.004），见表1。

2.3脊髓空洞体积

对NSCs/序贯移植术后1 w，6 w的A组和B组大鼠行经心脏灌注法处死，固定脊髓段，切片制作标本并进行 HE 染色后，用 Image J1.38检测损伤区脊髓空洞体积显示：1 w时，A 、B两组大鼠脊髓损伤区可见明显的脊髓空洞，体积差异无统计学；6 w时，B组大鼠脊髓损伤区脊髓空洞（0.17±0.08）mm3 较A组（0.39±0.09）mm3 体积小，见图4，得知对照组和实验组之间的差别具有统计学意义（t=3.164， P=0.034）。

2.4组织学评价结果

2.4.1 MAP-2结果及光密度分析 对NSCs/序贯移植术后3 w的A组和B组大鼠行经心脏灌注法处死，固定脊髓段，切片制作标本并进行MAP-2染色后，镜下观察序贯移植组损伤区及周围MAP-2阳性表达排列完整呈短束状，染色较强，形态规则，染色均匀；而NSCs移植组损伤区及周围MAP-2阳性表达排列紊乱，染色明显较少较淡。用 Image-Pro Plus 6.0检测损伤区MAP-2光密度显示，经过序贯静脉移植处理的实验（B）组大鼠脊髓损伤区MAP-2阳性积分光密度（129765±9617）较对照（A）组（90806± 9046）体积大，见图5，得知对照组和实验组之间的差别具有统计学意义（t=-5.315，P=0.006）。

2.4.2 GFAP染色结果及光密度分析 对NSCs/序贯移植术后3 w的A组和B组大鼠行经心脏灌注法处死，固定脊髓段，切片制作标本并进行GFAP染色后，镜下观察可见序贯移植组与NSCs静脉移植处理的对照组GFAP皆呈点状表达，而对照组表达高于序贯移植组。 用Image-Pro Plus 6.0检测损伤区GFAP光密度显示，经过序贯静脉移植处理的实验（B）组大鼠脊髓损伤区GFAP阳性积分光密度（37462±4230）较对照（A）组（89288±3992）体积小，见图6，得知对照组和实验组之间的差别具有统计学意义（t=15.868，P=0.001）。

由两组SCI大鼠术后BBB评分对比可知：在损伤3 d内两组大鼠的运动功能均未恢复，3 d后两组大鼠运动功能开始恢复且序贯组大鼠比对照组大鼠恢复更快，至第8 w两组大鼠BBB评分趋于稳定，序贯组大鼠的神经功能恢复更好；由两组SCI大鼠治疗后脊髓损伤区脊髓空洞结果对比可知：在1 w时，两组大鼠脊髓损伤区的脊髓空洞体积差异不大，而在6 w时，序贯移植组脊髓空洞体积较对照组更小；由两组SCI大鼠治疗后脊髓损伤区MAP-2、GFAP免疫组化染色对比可知：序贯组大鼠脊髓损伤区神经元特异标记物MAP-2的细胞明显增多，而星形胶质细胞的特异性标记物GFAP的细胞明显减少，可见NSCs向神经元分化增多，而向星形胶质细胞分化减少。

3讨论

脊髓损伤后损伤部位会形成抑制NSCs的存活，定植及分化的微环境：脊髓损伤后局部的出血、炎症、缺血、乏氧及高酸性环境影响NSCs的生存和定植 ；如前炎症因子：肿瘤坏死因子a（tumor necrosis factor-alpha TNFa）可通过激活Bcl-2家族的PUMA诱导神经前体细胞的凋亡[4]；而损伤后免疫系统的激活加重了对NSCs的损害；其又可通过加重胶质疤痕的形成阻碍已分化神经细胞的生长[8]，当神经细胞触及到胶质疤痕后即引发生长的停滞[9]；而由此引起脊髓空洞的扩大干扰了NSCs的生存、分化及神经元轴突的延伸，使得神经干细胞主要分化为胶质细胞，形成大量瘢痕组织，而极少分化为神经元[4，10]。

在2013年，Forostyak提出了间充质干细胞能改善脊髓损伤的微环境。同时在体外，本课题组已证实大鼠的BMSC-CM能够促进NSCs贴壁分化为神经元和神经胶质细胞。众所周知，神经元细胞是脊髓中主要的功能细胞，有利于脊髓损伤功能的改善；而星形胶质细胞主要形成胶质疤痕，其增多不利于SCI的修复和功能改善。本实验证明在体内，MSCs与NSCs序贯移植后大鼠脊髓损伤区NSCs向神经元分化增多，而向星形胶质细胞分化减少，序贯移植治疗能够促进脊髓损伤后神经功能的恢复、减小脊髓空洞体积。可以认为MSCs可促进了NSCs的有效分化，减少胶质化倾向，有利于治疗SCI。

目前关于序贯治疗仍是一片空白，本实验组提出的这种观点是基于以往的多项研究成果，既然间充质干细胞可以改变脊髓损伤区的微环境从而减少神经干细胞死亡，而神经干細胞又是目前来说研究的最成熟的可以用于细胞移植治疗SCI的人体细胞，那么我们可以将间充质干细胞与神经干细胞结合，首先利用间充质干细胞移植到脊髓损伤局部，改善脊髓损伤部位的微环境，使之有利于神经细胞的生存，再移植神经干细胞来治疗脊髓损伤，让神经干细胞更好的发挥替代治疗效应。序贯移植治疗可以作为突破脊髓损伤难以治疗这个难题的一个方向，在未来的研究中我们要做更深入的探索——间充质干细胞在体内分泌了什么物质影响微环境，这种物质可以被替代吗？序贯移植的最佳时机？神经干细胞还可以与什么细胞联合？等等以上问题都是我们未来需要探索的。endprint

本实验由于技术和时间关系无法完成大体示踪。有关研究可在今后进行。

4 结论

经本次完整实验后可得出结论，骨髓间充质干细胞与神经干细胞序贯静脉移植修复大鼠脊髓损伤时BMSCs可促进了NSCs的有效分化，减少胶质化倾向，同时 BMSCs减轻了局部炎性反应，减少脊髓空洞和疤痕形成，序贯移植治疗有利于脊髓损伤的修复和功能改善。

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编辑/成森endprint