王涛，强艳丽

(胜利油田中心医院，山东东营 257034)

脂肪干细胞对小鼠放射性唾液腺损伤的治疗作用

王涛，强艳丽

(胜利油田中心医院，山东东营 257034)

目的探讨脂肪干细胞对小鼠放射性唾液腺损伤的治疗作用。方法选取10只健康雄性C3H小鼠作为脂肪干细胞供体，分离培养小鼠脂肪干细胞。选取30只雌性C3H小鼠并随机分为空白组、单射组和治疗组各10只；单射组、治疗组予以15 Gy放射线照射小鼠头颈部，制作放射性唾液腺损伤模型；空白组不照射。照射后1周，治疗组小鼠给予脂肪干细胞注射，每周2次，连续2周；对照组和单放组经尾静脉注射等量的PBS。分别于照射后1、5、10周测定唾液分泌率。照射后10周收集小鼠下颌下腺，并测定腺体占体质量的比例、腺泡细胞面积以及细胞增殖率。结果脂肪干细胞注射后，治疗组小鼠唾液流量逐渐上升，在放射后10周，治疗组高于单射组(P<0.05)。空白组小鼠腺泡细胞表面积占下颌下腺总表面积的百分比为72%±10%，治疗组为65%±13%，单射组为34%±9%,空白组和治疗组腺泡细胞表面积均高于单射组(P均<0.05)。空白组唾液腺细胞增值率为10.0%±0.12%，单射组为3.6%±0.14%,治疗组为8.1%±0.18%,单射组唾液腺细胞的增殖率低于治疗组、空白组(P均<0.05)。结论脂肪干细胞能够明显改善放射损伤的唾液腺功能，促进唾液分泌，提高腺体细胞的增殖率。

脂肪来源干细胞；唾液腺；放射性损伤；小鼠

唾液腺损伤是头颈部肿瘤患者放射治疗的常见并发症[1]，可引起口干、口腔黏膜炎、猖獗性龋以及味觉和进食障碍，严重影响患者的生活质量[2,3]。目前，临床上还没有十分有效的唾液腺损伤防治手段[4]。脂肪来源干细胞(ADS)作为一种重要的间充质干细胞，具有成骨、成脂、成软骨分化、自我复制以及免疫调节等生物学功能[5]。脂肪细胞因其提取方法简单和干细胞密度高等优势被广泛应用于医学组织工程领域。2016年7～12月，我们从小鼠脂肪组织中提取干细胞并移植到放射性唾液腺损伤模型小鼠体内，观察其对放射性损伤的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：10只健康雄性C3H小鼠作为脂肪干细胞供体。30只放射性唾液腺损伤雌性C3H小鼠随机分为空白组、单射组、治疗组各10只。所有小鼠均为8周龄，体质量18～23 g。主要试剂及仪器：医用直线加速器(Varian Clinic Trilogy)、PAS染色试剂盒(美国Sigma公司)、PCNA染色试剂盒(美国Invitrogen公司)。

1.2 小鼠脂肪干细胞体外分离培养及鉴定 8周龄雄性C3H小鼠脱颈处死后从腹股沟处取脂肪组织。脂肪组织用含有5%青、链霉素的PBS冲洗3遍后，切成小块，以0.075%的I型胶原酶在37 ℃恒温摇床消化1 h，加入相同体积的α-MEM+20%胎牛血清中和消化酶。吸管反复吹打以充分分离细胞，2 000 g离心10 min以分离脂肪组织和细胞沉淀物，弃上清。加入细胞培养液重悬细胞，接种在T-75培养瓶中，每3 d换液1次。取第3代培养小鼠脂肪干细胞分别用成脂和成骨诱导液进行诱导分化21 d，再分别用油红O和茜素红染色鉴定成脂和成骨诱导分化情况[6]。显示脂肪干细胞镜下呈成纤维细胞样形态，经诱导后可分化成脂肪细胞和成骨细胞。

1.3 放射线照射及干细胞注射 雌性C3H小鼠腹腔注射苯巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉。小鼠头部充分暴露于放射野内，其余部位用铅板遮挡。单射组、治疗组予以15 Gy放射线照射；空白组操作步骤同单射组、治疗组，但直线加速器不运行。放射损伤后1周，治疗组小鼠接收干细胞治疗。取80%融合的第3代小鼠脂肪干细胞，0.25%胰蛋白酶消化离心后重悬于PBS中，细胞密度为1×106/100 μL。经尾静脉注射100 μL细胞悬液至干小鼠体内，每周2次，连续2周。空白组、单射组小鼠不接受干细胞悬液注射。

1.4 唾液分泌率及唾液腺质量测定 于照射前及照射后1、5、10周测定小鼠唾液分泌量。苯巴比妥钠麻醉小鼠，皮下注射毛果芸香碱(2 mg/kg)后将小鼠倾斜固定。将分血器一端置于小鼠口角，另一端置于预称量0.5 mL离心管中，收集唾液10 min，之后将离心管称重，计算唾液分泌率。10周后小鼠脱颈处死，取下颌下腺称量，计算下颌下腺占体质量的百分比；然后组织浸入4%多聚甲醛溶液中固定，脱水石蜡包埋。

1.5 唾液腺细胞表面积及细胞增殖率检测 将石蜡包埋的标本切片，常规脱腊水化。按照试剂盒说明方法进行PAS染色，200倍光学显微镜下观察拍照。用ImageJ软件计算腺泡细胞表面积占整个标本面积的百分比。5 μm厚石蜡切片常规脱腊水化，热抗原修复后，按常规免疫组化步骤染色，400倍光学显微镜下观察拍照。用ImageJ软件计算唾液腺细胞增殖率。

2 结果

2.1 三组唾液分泌率 单射组、治疗组小鼠在照射后1周唾液分泌率下降至空白组的50%，与空白组比较有统计学差异(P均<0.05)。治疗组接受干细胞移植后，唾液分泌率逐渐上升，至照射后10周接近空白组；而单纯照射组持续下降。照射后10周，治疗组唾液分泌率高于单射组(P<0.05)。如图1。

图1 脂肪干细胞治疗对小鼠唾液分泌率的影响

2.2 三组唾液腺质量占体质量的百分比 照射后10周，空白组小鼠下颌下腺占体质量的百分比为0.40%±0.09%，治疗组为0.37%±0.07%，单射组为0.3%±0.06%。三组唾液腺质量占体质量的百分比无统计学差异(P>0.05)。

2.3 三组唾液腺组织学及腺泡细胞表面积变化 PAS染色组织学形态显示，单射组在照射后10周出现大量纤维化组织，腺泡细胞严重萎缩，组织间质内可见炎性细胞浸润。而空白组和治疗组小鼠唾液腺组织结构保存完整清晰，导管及腺泡细胞排列致密。空白组小鼠腺泡细胞表面积占下颌下腺总表面积的百分比为72%±10%，治疗组为65%±13%，单射组为34%±9%；空白组和治疗组腺泡细胞表面积均高于单射组(P均<0.05)，治疗组与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 三组唾液腺细胞增殖率 空白组唾液腺细胞增值率为10.0%±0.12%，单射组为3.6%±0.14%。治疗组为8.1%±0.18%；单射组唾液腺细胞的增殖率低于治疗组、空白组(P均<0.05)，治疗组与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

唾液腺功能损伤是头颈部肿瘤放射治疗的常见并发症之一。Nagler[7]研究表明，放射线能够造成腺泡细胞DNA损伤，从而失去增殖能力，成为放射性损伤后期恶化的主要原因。Savage等[8]也提出低剂量的放射线能够导致细胞凋亡，高剂量的放射线则直接导致组织坏死。另外放射治疗引起的炎症反应也能够破坏唾液腺实质细胞。另外有研究提出放射线能够诱导脂肪过氧化反应，从而损伤腺泡细胞内的分泌颗粒，产生自由基，最终导致细胞溶解[9]。但是此研究结果不能解释患者在反射性损伤早期腺泡细胞大量凋亡前就出现唾液腺功能减低的症状。于是又有研究提出放射线能够破坏细胞膜上M受体介导的唾液分泌，从而导致损伤初期唾液流量急剧下降[10]。

目前临床上唾液腺功能损伤多以保守治疗为主，M受体激动剂(如毛果芸香碱)常用于刺激患者唾液分泌。然而放射性损伤后期，大部分腺泡细胞损失，此类药物效果有限。另外，药物治疗常伴随多种不良反应，如恶心、腹泻及盗汗等，也限制了药物的长期应用[11]。尽管新的放疗方法能够降低对唾液腺的损伤，如调强放疗, 但仍有40%患者有放射后唾液腺功能损伤[12]。因此彻底修复唾液腺功能的治疗方法一直是实验室研究的热点。目前，多种来源的干细胞被用来修复放射性唾液腺损伤，包括骨髓基质干细胞和唾液腺来源的间充质干细胞。近期研究表明干细胞能够分泌多种细胞因子、生长因子以及其他活性成分，参与到组织损伤的修复过程中[13]。有研究者分别报道了全骨髓细胞和骨髓来源的间充质干细胞用于治疗放射性唾液腺损伤[14,15]。但是，骨髓干细胞分离技术复杂，对供体创伤大，且有可能引起严重并发症。脂肪干细胞提取分离步骤简单，患者依从性高。而且脂肪组织的干细胞密度较骨髓组织高。因此脂肪组织作为干细胞的另一重要来源被广泛应用于再生修复医学中。

唾液分泌率是反映唾液腺功能的重要指标，唾液分泌减低是口干综合症患者主要临床症状。本研究显示，照射后1周内单纯照射组唾液分泌率约为空白组的50%，说明放射性唾液腺损伤小鼠模型建立成功。干细胞治疗组与对照组唾液分泌率无差异，说明脂肪干细胞能够修复小鼠唾液腺功能，显著提高唾液分泌率。腺泡细胞是唾液腺内唯一分泌唾液水成分的部位，它也分泌了85%的唾液蛋白成分[16]，腺泡细胞的数量决定了放射损伤后期唾液分泌的量。本研究显示脂肪干细胞治疗能够降低放射线对腺泡细胞的损伤。增殖细胞核抗原对细胞增殖启动有重要作用，是增殖细胞的常用标记物之一。本研究观察放射线照射后10周的小鼠唾液腺细胞增值率，显示单射组低于空白组，说明放射线能够破坏唾液腺内组织干细胞，减少其增殖能力，从而进一步导致了腺泡细胞的表面积减少。脂肪干细胞移植可以保护腺体细胞，促进干细胞的分化增殖，从而修复放射对腺体造成的损伤。

综上所述，脂肪干细胞能够明显改善放射损伤的唾液腺功能，促进唾液分泌，提高腺体细胞的增殖率，有望将来用于临床治疗放疗引起的唾液腺功能损伤。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.33.010

R739.87

A

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强艳丽(E-mail：kqqiangyanli@163.com)

2017-05-19)