程涛，陈宇，张宁坤，高连如，王泽，张燕

(1安徽医科大学海军临床学院，北京100048；2中国人民解放军海军总医院)

·论著·

Apelin13对人胚胎干细胞定向心肌细胞分化效率的影响

程涛1,2，陈宇1,2，张宁坤2，高连如2，王泽2，张燕2

(1安徽医科大学海军临床学院，北京100048；2中国人民解放军海军总医院)

目的探讨Apelin13对人胚胎干细胞(hESCs)定向心肌细胞分化效率的影响。方法将hESCs单层培养后经EDTA消化传代，应用明确的诱导分化培养基对观察组(加Apelin13)和对照组(不加Apelin13)定向诱导hESCs向心肌细胞分化。于诱导第2天(中胚层阶段)、第4天(心肌分化初始阶段)、第7天(心肌分化末阶段)作为时间节点，采用实时荧光定量PCR检测两组Brachury T、Mesp1、NKx2.5、APJ mRNA表达水平，采用Western blotting检测两组Brachury T、Mesp1、NKx2.5、APJ、Nanog、Sox2蛋白表达；同时于诱导第7天采用细胞免疫荧光技术检测两组心肌细胞标志物肌钙蛋白T2(TNNT2)、α-辅肌蛋白(α-actinin)表达。结果诱导第7天观察组hESCs定向心肌分化程度高于对照组，免疫荧光染色倒置显微镜下可清楚看到成熟心肌细胞的肌结及心肌细胞TNNT2、α-actinin表达。在3个诱导时间节点，观察组Brachury T、Mesp1、NKx2.5、APJ mRNA及其蛋白表达均高于对照组(P均<0.05)，观察组hESCs标志蛋白Nanog、Sox2低于对照组(P均<0.05)。结论Apelin13可提高hESCs向心肌细胞的分化效率。

人胚胎干细胞； Apelin13;心肌细胞； 细胞分化

Abstract:ObjectiveTo explore the effects of Apelin13 on the differentiation of human embryonic stems cells (hESCs) into myocardial cells.MethodsFeeder-free cultured hESCs were passaged into Matrigel-coated plates after being dissociated by EDTA. The cells were cultured in the differentiation medium with 100 nM Apelin13 (experimental group) or without Apelin13 (control group). On day 2, 4, and 7 of induction, real-time fluorescent quantitative PCR (qRT-PCR)was performed to detect the mRNA levels of the myocardial marker genes, including Brachyury T, Mesp1, Nkx2.5, and APJ. Meanwhile, the protein expression levels of Brachyury T, Mesp1, Nkx2.5, APJ, Nanog, and Sox2 were determined by Western blotting. Furthermore, the expression of TNNT2 and α-actinin at the transcription and protein levels in the differentiated myocardial cells after 7 days of induction was determined by fluorescent quantitative PCR and immunofluorescence, respectively.ResultsDuring the differentiation process, the introduction of Apelin13 promoted hESC differentiation, most significantly on day 7. Compared with the control group, the qRT-PCR showed that Apelin13 significantly increased the mRNA levels of Brachury T and Mesp1 after 2 days of induced differentiation, and Nkx2.5 and APJ after 7 days of differentiation. Western blotting showed the similar results with increased expression of Brachury T, Mesp1, Nkx2.5, and APJ after differentiation for 2, 4, and 7 days, and significant decrease in the expression of Nanog and Sox2. The differentiated myocardial cells after 7 days of culture also showed obviously positive expression of TNNT2 and α-actinin. Furthermore, the qRT-PCR demonstrated that Apelin13-treated cells showed much higher levels of TNNT2 and α-actinin after 7 days of induced differentiation (all P<0.05).ConclusionApelin13 can improve the differentiation efficiency of hESCs into myocardial cells.

Keywords: human embryonic stem cells; Aplelin13； myocardial cells; cell differentiation

血管紧张素受体(AT1-R)相关受体蛋白(APJ)为7次跨膜G蛋白偶联受体，其30%的氨基酸序列与AT1-R相同，两者属于同源蛋白[1]。Apelin为APJ的内源性配体。Apelin/APJ系统广泛表达于体内各个系统，共同发挥生物学效应。Apelin基因编码77个氨基酸前体蛋白原，可被水解酶裂解为大小长度不同的多肽，其中最主要的裂解产物是Apelin13、Apelin36，均为APJ的内源性激动剂。研究发现，Apelin可以对表皮生长因子tdgf-1基因进行调控，从而影响小鼠胚胎干细胞向心脏的定向发育。然而，Apelin/APJ是否对人胚胎干细胞(hESCs)向心肌定向分化的过程产生影响，尚未研究清楚。2016年5月～2017年5月，我们就Apelin13对hESCs定向心肌细胞分化的影响进行了观察。

1 材料与方法

1.1 主要材料 E8完全培养基、EDTA人多能干细胞传代工作液、PBS、Basement Menbrane Matrix、Brachury T抗体、Mesp1抗体、APJ抗体、Nkx2.5抗体、Nanog、Sox2(美国Abcam公司)；肌钙蛋白T2(TNNT2)抗体、α-辅肌蛋白(α-actinin)、FITC标记的羊抗兔抗体、FITC标记的羊抗鼠抗体(美国Santa Cruz公司)；TRIzol试剂、逆转录试剂盒(美国Invitrogen公司)；Oligo(dT)、dNTP、RNase Inhibitor(美国Takara公司)；ReverTra Ace、buffer (Toyobo)、SYBR Select Master Mix(美国Life公司)；氯化钠、酵母粉、蛋白胨、卡那霉素、IPTG、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、N，N-甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、甘氨酸、三羟基氨基甲烷、甲醇、乙醇、异丙醇、过硫酸铵、十二烷基磺酸钠、β-巯基乙醇、四甲基乙二胺、吐温20等购自国药集团化学试剂北京有限公司。倒置相差显微镜(日本NIKON公司)；CO2培养箱(美国Thermo公司)；共聚焦显微镜(德国莱卡公司)；电泳仪。

1.2 hESCs培养及传代 将Matrix按1∶100的比例稀释成生物活性减量工作液，在6孔板中每孔加入1 mL的Matrix工作液，置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育4 h。将板置于超净工作台，弃上清，每孔加入1 mL的E8完全培养基。将hESCs均匀接种于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养，当细胞汇合度达到80%以上时，进行细胞传代。用于传代的细胞培养基弃上清，用无钙镁的PBS溶液清洗1次，加入1 mL的EDTA传代工作液使之完全覆盖板底，室温孵育10 min。在显微镜下观察到细胞边缘卷起，细胞间隙明显可见，停止消化，弃消化液，加入1 mL的E8完全培养基工作液轻轻吹打培养板，以每孔2×104的细胞密度接种于包被过Matrix工作液的6孔板中，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中传代培养。

1.3 hESCs向心肌诱导分化 hESCs经EDTA传代工作液消化，弃上清，PBS洗涤、重悬，调整细胞密度为1×105/mL，接种于6孔板中。将细胞分为添加100 nmol/L Apelin13的观察组和未加入Apelin13 的对照组，皆置于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞汇合度达到约95%时，弃去E8完全培养基，替换为每孔2 mL的心肌诱导分化培养基CDM3；同时每孔继续加入2 mL含有6 μmol/L CHIR99021 的CDM3心肌诱导分化培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h。之后弃上清，加入含2 μmol/L Wnt C59的CDM3心肌诱导分化培养基，继续置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h。之后将原培养基换成CDM3培养基，置于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每隔48 h换CDM3培养液1次，直到出现跳动的心肌细胞。

1.4 心肌细胞鉴定 诱导分化第7天，分别取两组6孔板的1个孔内细胞进行免疫荧光染色。取出6孔板细胞爬片，PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3遍，室温下0.5%的Triten100打孔15 min，加3% BSA封闭30 min，1∶100稀释的α-actinin和TNNT2抗体4 ℃过夜，PBS洗3次，再加入1∶100倍稀释的羊抗鼠的二抗，室温避光孵育1 h，在共聚焦显微镜下观察细胞荧光染色情况。

1.5 心肌特异性mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR法测定。分别收集两组hESCs诱导前、诱导第2天(中胚层阶段)、第4天(心肌分化初始阶段)、第7天(心肌分化末阶段)细胞，利用TRIzol法提取出细胞的总RNA，操作步骤按照试剂盒说明书进行。依据Ct值，利用2-ΔΔCt法以GAPDH的量为内参，计算心肌特异性标志物Brachury T、Mesp1、Nkx2.5、APJ mRNA表达水平。

1.6 心肌特异性蛋白表达检测 采用Western blotting法检测。分别收集两组hESCs诱导前、诱导第2、4、7天细胞，用PBS漂洗2遍，每孔加入200 μL细胞裂解液，4 ℃裂解30 min，12 000 g离心5 min后收集上清，加入适量蛋白上样缓冲液，沸水浴5～10 min。将制备的蛋白样品进行SDS-PAGE(12%)，电泳后采用湿法转膜；转膜后用5%脱脂奶粉(购自BD)室温封闭2 h，TBST漂洗后加入适度稀释的一抗，4 ℃孵育过夜。次日去掉一抗，用TBST漂洗3遍，每次10 min，然后加入适度稀释的羊抗鼠二抗，室温孵育2 h。去掉二抗，用TBST漂洗3遍，每次10 min，最后用ECL进行显影。检测心肌特异性特标志物Brachury T、Mesp1、Nkx2.5、APJ蛋白及hESCs标志性蛋白Nanog、Sox2的表达。

2 结果

2.1 hESCs培养和传代 hESCs接种于6孔板5 min后开始贴壁，培养第1天用倒置显微镜可以观察到hESCs体积较小、核大、核仁明显，形成克隆单位，呈集落生长；第2天细胞排列紧密，集落增大，边缘光滑；第4天之后各细胞集落出现融合现象。

2.2 hESCs向心肌诱导分化情况 观察组hESCs在诱导分化的第2天向中胚层阶段分化的更多，第7天出现了更加明显的心肌细胞集落。

2.3 心肌细胞鉴定 诱导分化第7天，免疫荧光染色倒置显微镜下观察组可以清楚的看到成熟心肌细胞的肌结及心肌细胞的标志物TNNT2、α-actinin表达，观察组TNNT2、α-actinin表达高于对照组。

2.4 不同诱导阶段心肌特异性标志mRNA的表达 中胚层的标志物Brachury T mRNA在诱导第2天最高，之后表达迅速下降；心肌分化开始的标志物Mesp1 mRNA在第2天开始上升，第4天表达下降；而Apelin的受体APJ mRNA不受时间限制，是跨越hESCs发育中胚层早、中、晚期及定向心血管分化发育三阶段的共同标志物。观察组Brachury T、Mesp1、Nkx2.5、APJ mRNA表达均高于对照组(P均<0.05)。见表1。

表1 不同诱导阶段心肌细胞特异性标志mRNA的表达

2.5 不同诱导阶段心肌特异性标志蛋白的表达及hESCs标志性蛋白的变化 在所选的诱导时间节点中，观察组阶段性蛋白标志物Brachury T、Mesp1、Nkx2.5、APJ明显比对照组高(P均<0.05)。hESCs标志蛋白Nanog、Sox2表达量随诱导分化时间增加进行降低，观察组Nanog、Sox2表达量与对照组比较有统计学差异(P均<0.05)。见图1。

图1 不同诱导阶段心肌细胞特异性标志蛋白及hESCs标志蛋白的表达

3 讨论

研究显示，APJ与心力衰竭、缺血性心脏病、肺动脉高压型心脏病、高血压、心肌肥大、心房颤动等心血管疾病密切相关[2, 3]，APJ的增高或降低对心血管疾病的发生与发展有重要影响。但影响APJ增高或降低的机制尚未清楚，因此寻找APJ受体的激动剂或抑制剂尤为重要[4]。因此Apelin作为新发现的APJ激动剂，目前已成为新的医学研究热点。本研究采用Apelin13成功诱导了hESCs向心肌细胞分化。细胞形态学观察显示，诱导第7天有跳动的心肌细胞出现，细胞呈短柱状，细胞核位于中部，边缘清晰，细胞间紧密相联。Western blotting检测，hESCs表面蛋白标志物Nanog、Sox2随着分化进行表达逐渐减少，干细胞的特性逐渐消失；而心肌分化阶段性蛋白Brachury T、Mesp1、NKx2.5、APJ表达增多。免疫荧光检测可见心肌细胞的闰盘、肌节结构，成熟心肌细胞标志性蛋白TNNT2、α-actinin表达。诱导第7天观察组TNNT2、α-actinin表达高于对照组。证明Apelin可以通过增强APJ的效果，提高hESCs向心肌细胞的分化效率[5]。

Apelin在胚胎形成时期对血管的形成至关重要。在青蛙胚胎发育时期中观察到Apelin/APJ基因共同表达在体节间血管，此区域日后形成脉管系统[6]。在发育生物学的研究中发现，斑马鱼胚胎发育过程中Apelin表达于胚体中线处，它的胚体APJ在边缘中胚层叶祖细胞中表达。当敲除Apelin基因时，胚胎体节间血管的血液流出口径变窄，引起胚胎的死亡；当敲除APJ基因时，出现心肌前体细胞缺失，心肌结构无法发育成熟；同时Apelin/APJ信号通路被中断，原始条纹中的中胚层细胞无法迁移至生心区-前侧叶胚区域，严重影响心脏发育[7, 8]。这些结果都可以证明Apelin/APJ信号传导系统影响着心脏祖细胞的迁移、分化，Apelin/APJ的表达是hESCs向心脏方向特定分化的一个重要标志。

胚胎发育过程中，原始心脏祖细胞分化为平滑肌细胞、心肌细胞、内皮细胞等，分化过程经过复杂的信号网络、转录因子等调节，定向分化为心脏和血管。因此定向分化的心脏前体细胞有可能实现真正的心脏再生，同时避免了多潜能干细胞的致瘤性问题；而心脏前体细胞所表达的特异性标志物可以准确判断hESCs是否向着心血管方向分化。本研究检测的Nanog基因，最早表达于桑椹胚阶段，是hESCs维持自我更新、亚全能性、不分化特征的标志物，同时也是hESCs向各类细胞分化的总开关。随着hESCs向心肌细胞分化，Nanog表达逐渐减少甚至消失，干细胞的全能性也趋于降低。Sox2蛋白在小鼠的成熟卵母细胞中高表达，卵圆柱期在外胚层和胚外外胚层的位置高表达。在体外，Sox2基因在ESCs中高表达，但随着ESCs的分化逐渐降低或消失。因此，Nanog和Sox2 是验证hESCs全能型的特异性标志蛋白[9]。Brachury T、Mesp1、NKx2.5和APJ在诱导前有不同程度的低量表达，诱导开始后表达逐渐增强，诱导1周后，hESCs形态改变，心肌细胞标志性蛋白TNNT2、α-actinin表达显著增加。有研究发现，Brachury T、Mesp1、NKx2.5和APJ四种基因可以和心肌的肌钙蛋白、肌球蛋白的启动子结合，对这些结构基因的表达起启动或增强作用[10]。本研究在Apelin13促进hESCs定向心肌分化过程中，推测Apelin13可能促进了这四种基因的表达，从而促进肌小节、闰盘的形成，促进心肌细胞的分化成熟。

α-actinin是细胞骨架和细胞内肌丝的组成部分；心肌细胞早期特异性标志物TNNT2参与心肌的收缩和舒张，为心肌晚期特异性标志物。这两种蛋白高表达，说明了hESCs已分化为成熟的心肌细胞。Brachury T是代表hESCs发育中胚层早期的标志物，Nkx2.5为定向心肌分化的起始标志物，参与心肌前体细胞的形成过程；Mesp1在hESCs迁移至原始胚纹时开始表达，Mesp1阳性的hESCs可以分化出成熟的心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞，是中胚层心脏祖细胞的标志[11]。

目前，促进hESCs进行心肌分化的研究方法较多，如二甲基亚砜(DMSO)、5-氮胞苷(5-AZA)、维甲酸(RA)、环孢菌素A(CSA)等都具有一定促进心肌分化的作用，但DMSO、5-AZA具有细胞毒作用，可诱导细胞凋亡；RA和CSA作为抗肿瘤药物，细胞毒性作用更大[12]。相比之下，Apelin对细胞的毒性作用小，可以提高心肌细胞诱导率，此为干细胞治疗心肌梗死等一系列心血管疾病提供了新的思路，也为再生医学治疗坏死的心肌细胞提供了巨大的前景。

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Effects of Apelin13 on efficiency of hESCs differentiating into myocardial cells

CHENGTao1,CHENYu,ZHANGNingkun,GAOLianru,WANGZe,ZHANGYan

(1NavyClinicalCollegeofAnhuiMedicalUniversity,Beijing100048,China)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.33.001

R349.5

A

1002-266X(2017)33-0001-04

国家自然科学基金资助项目(81370238)；北京市自然科学基金资助项目(7142156)。

程涛(1993-)，女，硕士研究生，研究方向为干细胞心肌分化。E-mail:1139353344@qq.com

陈宇(1970-)，女，副主任医师，副教授，硕士生导师，主要从事干细胞移植的基础和临床研究。E-mail:YuChen911@hotmail.com

2017-05-27)