惠青山，吴芷芷，程琳

银杏提取物联合顺铂对人胶质瘤U251细胞增殖凋亡的影响

惠青山，吴芷芷，程琳

（潍坊护理职业学院，山东 青州 262500）

目的 研究银杏提取物（GBE）联合化疗药物顺铂对人脑胶质肿瘤细胞生长增殖和凋亡的影响。方法 正常培养传代后的U251胶质瘤细胞按随机分配的方法分为4组，A组仅加普通培养液，B、C、D组分别加银杏提取物（200 mg/mL）0.5 mL、顺铂（1 mg/mL）0.01 mL、银杏提取物（200 mg/mL）0.5 mL＋顺铂（1 mg/mL）0.01 mL；MTT法观察U251细胞增殖情况，流式细胞仪检测U251细胞凋亡率。结果 培养12、24、36、48、60 h，B、C、D组细胞增殖指数逐渐下降，与A组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）；D组与B、C组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。将各组细胞培养24 h后上机，测得A组、B组、C组、D组肿瘤细胞的凋亡率分别为（0.6±0.3）%、（19.3±1.2）%、（38.9±3.5）%、（58.1±3.1）%。其中，B组、C组、D组分别与A组进行比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；将D组与B组和C组进行比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论 银杏提取物（GBE）联合顺铂可抑制人脑胶质瘤U251细胞增殖，并诱导其凋亡。

银杏提取物（GBE）；U251胶质瘤细胞；顺铂抗肿瘤药物；凋亡

在脑肿瘤治疗中，中成药的辅助治疗是一种重要的辅助手段，近年来，对银杏提取物以及其制剂的研究不仅在治疗心血管以及中枢神经系统的病变获得突破[1-6]，在对肿瘤的治疗上也备受关注。银杏提取物是富含多种聚戊烯醇（GP）、银杏黄酮、银杏外种皮多糖等多种抗肿瘤成分[7-8]，具有显著的对抗肿瘤生长特性并且具有辅助化学药物治疗的作用[9-11]。2017年1月我们进行了银杏提取物（GBE）联合顺铂对人胶质瘤细胞生长增殖和凋亡影响的实验研究，研究内容如下。

1 材料与方法

1.1 材料 U251人胶质母细胞瘤细胞株，DMEM培养基，小牛血清蛋白，MTT试剂，顺铂药物（药物浓度为1 mg/mL），异硫氰酸荧光素—碘化丙染色试剂。

1.2 实验方法

1.2.1 银杏提取物（GBE）制备方法[12]将银杏叶采用丙酮溶液提取后，除掉其脂溶、水溶性的物质成分和蛋白质、多聚糖等等一些高分子的化合物。

1.2.2 在显微镜下观察染色后每组肿瘤细胞的形态特点。

1.2.3 U251肿瘤细胞的增殖生长和抑制情况观察 把各分组细胞悬液的浓度调整为5×103/mL，接种96孔板，每孔1 mL，同时每组分别设置3个复孔。用缓冲溶液冲洗2遍后加入MTT试剂，然后在温箱中继续培养24 h后，采用酶联免疫检测仪测量570 nm波长下每组肿瘤细胞的光密度值（OD），来衡量细胞增殖和生长的情况。计算其抑制率。抑制率为1-实验组吸光度/对照组吸光度。

1.2.4 U251肿瘤细胞的凋亡率计算 将培养24 h后的各组肿瘤细胞，进行异硫氰酸荧光素/碘化丙染色荧光染色；然后在流式细胞仪上检测，按A、B、C、D组置孔，每组设置3个复孔，取得每组的3个数值，进行统计学分析，按“x±s”记录得出的每组肿瘤细胞的凋亡率。

1.3 统计学方法 本研究数据均用SPSS19.0统计软件处理，计量资料采用“x±s”表示，组间比较采用t检验；计数资料用例数（n）表示，计数资料组间率（%）的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 显微镜下观察染色后各组U251脑胶质瘤细胞的形态特点 A组U251肿瘤细胞条索样生长，细胞密度高；B组U251肿瘤细胞突起减少，肿瘤细胞数量也减少，且开始出现细胞空泡化现象；C组U251细胞边界开始模糊，细胞空泡和颗粒较为明显增多，出现许多凋亡小体：D组U251肿瘤细胞的数量明显减少，出现明显空泡化现象，并且有许多凋亡小体出现。见图1～4。

图1 空白组 Figure 1 blank group

图2 银杏提取物Figure 2 GBE group

图3 顺铂组Figure 3 DDP group

图4 联合组Figure 4 GBE+DDP group

2.2 各组U251细胞生长和抑制情况 培养12、24、36、48、60 h，B、C、D组细胞增殖指数逐渐下降，与A组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；D组与B、C组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。细胞的抑制率分别在培养12、24、36、48、60 h，均为A＜B＜C＜D。见表1、2。

2.3 各组U251细胞凋亡率的比较 将各组培养24 h后上机，测得A、B、C、D各组细胞的凋亡率分别为（0.3±0.2）%，（10.6±1.5）%，（35.9±2.8）%，（52.1±4.1）%。其中，B、C、D各组和A组进行比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；将D组与B、C组两组进行比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。U251细胞的凋亡率为A＜B＜C＜D，同时反映细胞被抑制程度为A＜B＜C＜D。

表1 各组U251细胞生长情况（x±s）Table 1 Growth of U251 cell after treated wth different drugs for different time(x±s)

表2 各组U251抑制率比较Table 2 Inhibition rate of U251 cell after treated wth different drugs for different time

3 讨论

银杏，孑遗植物。银杏叶具有很高的药用价值，主要以用于脑缺血、脑缺氧等临床治疗，而对其抗肿瘤的研究较少。近几年，研究表明，银杏提取物中的多种聚戊烯醇（GP）、银杏黄酮、银杏外种皮多糖化合物，含有具有显著的抗肿瘤活性[13-16]。其可能作用机制涉及抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫功能，调节细胞因子，诱导癌细胞分化和凋亡等[17-18]。本研究结果表明，银杏提取物（GBE）对U251肿瘤细胞的生长抑制现象要比对照组明显，并且凋亡率也明显增高。

顺铂作为一类临床常用的抗肿瘤药物，也是临床上较为有效的化疗药物之一，对多种肿瘤细胞的生长具有抑制能力，其中处于G期的肿瘤细胞最为敏感，仅应用顺铂就可以达到25%～50%的有效率，且少见有交叉耐药的现象。本研究结果表明，银杏提取物（GBE）联合顺铂治疗组较单独分别治疗的细胞抑制效果增强，而且细胞凋亡也增加。这表明，银杏提取物（GBE）可提高肿瘤细胞对顺铂的敏感性，两者有协同加强效果。其可能的原因是银杏提取物中的GBEP能调节免疫机制，影响bax基因的表达，从而诱导肿瘤细胞凋亡有关[19-20]。另外，顺铂可通过对机体免疫功能的调整，对肿瘤抗原调变的双重作用，从而增强银杏提取物提取物（GBE）的抗肿瘤作用[21]。

综上所述，银杏提取物（GBE）联合顺铂可抑制人脑胶质瘤U251细胞增殖，并诱导其凋亡，期望成为新型药物，填补化疗药物辅助的空白。

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The effect of Ginkgo Biloba Extracts combined with cisplatin on proliferation and apoptosis of human glioblastoma U251 cells

Hui Qing-shan,Wu Zhi-zhi,Cheng Lin
(Weifang Nursing vocational College,Qingzhou,Shandong,262500,China)

Objective To observe the effect of Cisplatin combinated with the Ginkgo Biloba Extracts on proliferation and apoptosis of U251 glioma cells.Methods Divide the handed U251cellsintofourgroupsrandomly.Add nutrient solution to A,whileaddactivatedGinkgoBilobaExtracts(200 mg/mL)0.5 mL to B,cisplatin(1 mg/mL)0.01 mL to C,Ginkgo Biloba Extracts(200 mg/mL)0.5 mL and cisplatin(1 mg/mL)0.01 mL to D.Observe the proliferation rate of U251 by MTT and analysis the apoptosis of U251 cells by the flow cytometric.Results The index of cell proliferation of B、C、D goroup declined Gradually with the training of 12 h,24 h,36 h,48 h,60 h.Compared B,C,D with A,the difference was statistically significant(P＜0.05),and compared group D with B and C,the difference was statistically significant(P＜0.05).After the training of 24 h,the cell apoptosis rate of group A,B,C,D was(0.6±0.3)%,(19.3±1.2)%,(38.9±3.5)%,(58.1±3.1)%respectively.Compared B,C,D with A,the difference was statistically significant(P＜0.05),and compared group D with B and C,the difference was statistically significant(P＜0.05).Conclusion Ginkgo Biloba Extracts combined with cisplatin can restrain the proliferation of U251 glioma and also lead to the apoptosis of U251 cells.

Ginkgo Biloba Extracts;U251 Glioma cells;CisplatinAntineoplastic Drugs;Apoptosis

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.28.004