许涵秋

(龙岩市产品质量检验所,福建 龙岩 364000)

实验技术

以二甲亚砜/正十二醇为二元致孔剂的新型苯乙烯-二乙烯苯毛细管整体柱的制备与表征

许涵秋*

(龙岩市产品质量检验所,福建 龙岩 364000)

首次以二甲亚砜/正十二醇为二元致孔剂，苯乙烯为单体，二乙烯苯为交联剂，过氧化苯甲酰为引发剂，通过原位聚合反应制备了苯乙烯-二乙烯苯聚合物型毛细管整体柱。结果表明，苯乙烯 ∶二乙烯苯 ∶二甲亚砜 ∶正十二醇的体积比为18.7∶15.3∶13.2∶52.8，即二甲亚砜占致孔剂的比例为20%，交联度为45%，致孔剂含量为66%为最优配比。所合成的整体柱实现了反相色谱模式下对小分子苯系物与生物大分子蛋白的快速分离。其中蛋白分离实验的流速达到104 μL·min-1，线速度约为12 mm·s-1，而常规色谱柱的线速度为1～2 mm·s-1。该整体柱的渗透性好，可用于物质的高速分离，若对其进行化学修饰，有望用于其它色谱分离模式。

二元致孔剂；苯乙烯-二乙烯苯；反相色谱；毛细管；整体柱；高速分离

整体柱(Monolithic column)是将单体、交联剂、致孔剂和引发剂等混合后通过原位聚合制备而成的棒状连续床层[1]，是一种可根据需要对整体材料的表面作相应衍生化处理的连续整体多孔结构。整体柱是应复杂样品体系(如生物样品、环境样品等)的快速、高效、高通量分析需要而发展起来的一种新型色谱柱，被誉为第4代分离介质[2]，具有如下优点：制备简单，可原位制备；聚合反应混合物中的单体可灵活选择以改变性质；通过控制聚合反应的条件可优化孔的性状；内部结构均匀；多孔，柱容量高；可用于快速分离；易于衍生化等[3-5]。

整体柱按其制备方法可分为聚合物整体柱、硅胶整体柱、以填充为基础的整体柱等[6]。聚苯乙烯类整体柱作为聚合物整体柱的一种，最早在1964年被提及，Fréchet小组[7-9]以及Premstaller小组[10-11]对聚苯乙烯整体柱的制备与应用做出了突出贡献。如今，聚苯乙烯类整体柱[12-13]因性能稳定、适用范围广等优点，被广泛用于有机小分子、蛋白质、核酸等的分离[14]。聚苯乙烯类整体柱使用的单体种类较少，目前所使用的单体仅为苯乙烯、氯甲基苯乙烯、二乙烯基苯等[6]，或者少数经功能团化学修饰的上述单体。引发剂为过氧化苯甲酰或偶氮二异丁腈[15]，交联剂为二乙烯基苯，致孔剂为甲醇、乙醇、丙醇、甲苯等[11]。

本方法首次引入二甲亚砜/正十二醇为二元致孔剂，充分考虑了致孔剂的选择对聚合物结构起的关键作用。二甲亚砜是一种常用试剂，易获得，稳定性好，不易与单体反应，对极性和非极性物质有较好的溶解性，可以更好地调节聚合物整体柱的孔结构，且较少用于聚合物整体柱的制备，而正十二醇具有易取得和毒性小的优点，因此用二甲亚砜和正十二醇作为致孔剂。考察了致孔剂的组成、交联度以及致孔剂含量对整体柱床结构与分离性能起的关键作用，采用最优配比制成了在反相色谱模式下对小分子与生物大分子均有快速分离效果的毛细管整体柱。采用扫描电镜观察该整体柱的微观结构和孔径分布；用逆体积排阻色谱法测孔径分布与孔隙率[16]；通过测量柱压与流动相流速的关系考察其通透性；用苯系物与蛋白质样品为目标探针测试该新型色谱整体柱的分离性能[17]。本方法中交联度是指聚合前体混合物中交联剂(二乙烯苯)的摩尔数占聚合前体(苯乙烯和二乙烯苯)总摩尔数的百分比。

1 实验部分

1.1 仪器、材料与试剂

高压注射泵(实验室自制)，KQ2200E医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，DHG-9076A 型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，XL-30环境扫描电子显微镜(荷兰Philips-FEI公司)，岛津LC-20A高效液相色谱(配CBM-20A 控制器，LC-20AD高压泵，SPD-20A二极管阵列检测器及LC Solution色谱工作站等，日本Shimadzu)，AB704-N电子天平(Mettler)，石英毛细管(530 μm，永年锐沣色谱器件有限公司)，一次性塑料注射器(1 mL，上海康德莱企业发展集团有限公司)。

NaOH、HCl、丙酮、甲苯、二甲亚砜、正十二醇、过氧化苯甲酰、乙腈、甲醇、硫脲、苯(分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司)；γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲基硅烷(分析纯，日本TCI公司)；苯乙烯(化学纯，广东汕头市西陇化工厂)；二乙烯苯(化学纯，Fluka公司)；聚苯乙烯标准品(分子量分别为5 000、2 000 00、2 000 000，美国Alfa-Aesar)；四氢呋喃(色谱纯，天津市光复精细化工研究所)；乙苯(化学纯，上海国药集团化学试剂有限公司)；正丙苯、正丁苯、正戊苯(分析纯，美国Alfa Aesar)，核糖核酸酶A、细胞色素C、肌红蛋白、三氟乙酸(色谱纯)均购自美国Sigma公司；去离子水(南京娃哈哈饮料有限公司)。

1.2 PS-DVB毛细管整体柱的制备

图1 内壁的活化与硅烷化示意图Fig.1 Activation and silylation of the capillary

毛细管的预处理：毛细管内壁活化与硅烷化的反应示意图如图1所示[18]。

毛细管柱的柱管材料选用530 μm内径的熔融石英毛细管，依次用色谱纯丙酮清洗15～30 min，1 mol·L-1NaOH溶液冲洗活化1～3 h，纯水冲洗1～2 h，0.5 mol·L-1HCl溶液冲洗2～3 h，纯水清洗毛细管内壁1 h，再充满丙酮，最后于气相色谱柱温箱中，通氮气干燥(160 ℃，1 h)，用硅橡胶块两端封口，保存于干燥处，使内壁获得丰富的游离型硅羟基。然后进行硅烷化，将γ-MAPS 与甲苯以体积比3∶7混合，再将此混合液注入毛细管(封口，室温过夜)，用丙酮洗，最后通氮气吹干。

图2 共聚反应示意图Fig.2 Process of copolymerization

整体柱的制备：管中原位整体聚合反应制备PS-DVB整体柱的反应原理如图2所示。

以苯乙烯与二乙烯苯为单体混合物，二甲亚砜和正十二醇为致孔剂，过氧化苯甲酰为引发剂。各单体混合物、致孔剂按一定的体积比混合，引发剂按反应单体混合物质量的1%加入。混合均匀，氮吹超声振荡脱气后用一次性注射器注入已预键合的毛细管中，两端封口。竖直放入烘箱，于70 ℃下反应24 h。最后，用高压平流泵驱动乙腈水溶液冲洗，除去致孔剂后即得到多孔结构的连续整体式毛细管液相色谱微柱。

1.3 PS-DVB毛细管整体柱的表征

1.3.1整体柱孔径分布的观察采用扫描电镜(SEM)观察整体柱的孔径分布。截取2～5 mm长度的一小段毛细管整体柱，用双面胶粘在铝合金座上，用环境扫描电子显微镜观察整体柱微观结构和孔径分布。每个整体柱至少记录3张电镜照片：柱截面整体形貌(200倍放大)，管壁与柱床键合层(2 000倍放大)，双孔结构(5 000倍放大)以及粒度分布(2 000倍放大)。

1.3.2整体柱孔径分布的考察采用逆体积排阻色谱法，用已知分子量的甲苯和聚苯乙烯标准品为目标探针，获得整体柱在湿态下的孔隙率和孔径分布。流动相为四氢呋喃(等度洗脱)，流速为0.005 mL·min-1，进样体积为0.2 μL，检测254 nm处的吸收强度。将所得数据作成峰强度～保留体积的谱图，即ISEC图。

1.3.3整体柱通透性的考察聚合物填料的耐压性是其用作HPLC固定相的重要参数，当其他色谱条件不变时，柱压降与流速呈线性关系[19]。以常用的色谱流动相(乙腈、纯水、甲醇、四氢呋喃)测整体柱的柱压与流速关系。考虑到柱子的承受能力，选择流速在0～300 μL· min-1范围内变化。

1.3.4整体柱对小分子物质的分离能力以苯系物样品为目标探针测试整体柱对小分子的分离性能。混合样品的配制如下：硫脲0.1 g，苯100 μL，甲苯90 μL，乙苯110 μL，丙苯100 μL，丁苯110 μL，用ACN-H2O(体积比7∶3)溶解并定容至10 mL，混匀。

接入自制的整体柱，流动相为ACN-H2O(体积比7∶3)，等度洗脱，流速为0.013 mL· min-1，进样体积为0.2 μL，检测254 nm处吸收强度。

1.3.5整体柱对大分子物质的分离能力以蛋白质样品为目标探针测试整体柱对大分子的分离性能。混合样品的配制如下：以ACN-H2O(7∶3)溶解并制成核糖核酸酶标准溶液1.0 g·L-1，细胞色素标准溶液0.93 g·L-1，马肌红蛋白标准溶液1.0 g·L-1，再以体积比1∶1∶1混合。

接入自制的整体柱，流动相为0.05% TFA-CAN/0.05% TFA-H2O，梯度洗脱，流速为0.050 mL·min-1，进样体积为0.2 μL，检测214 nm处吸收强度。

2 结果与讨论

2.1 致孔剂组成的影响

将单体与交联剂占聚合混合物的比例定为30%，交联度定为50%，二甲亚砜占致孔剂的比例由0%～100%变化，考察致孔剂组成的影响。结果表明，随着致孔剂中二甲亚砜含量的增大，聚合物的孔径与粒径逐渐减小。这符合相分离机理，二甲亚砜对聚合物种子是良溶剂，使得相分离推迟，进而表现为聚合物的孔径与粒径逐渐减小。结果发现，二甲亚砜占致孔剂的比例为20%时孔径分布最好，此时聚合物对小分子的苯系物和大分子的蛋白质样品均有较好的分离效果[20]。

2.2 交联度的影响

固定单体与交联剂占聚合混合物的比例及二甲亚砜占致孔剂的比例分别为30%、20%，交联度由10%～50%变化。结果显示，随着交联度的增大，聚合物的孔径逐渐减小，而粒径并未明显变化。这是由于随着交联度的增大，交联剂含量增加，相分离较早发生，使得聚合物的孔径下降。并且由于对粒径起主导作用的致孔剂含量相同，且交联度的变化范围较小，故粒径并未明显变化。

当交联度为45%与50%时，对小分子的苯系物和大分子的蛋白质样品均有较好的分离效果。同时，考虑到采用功能基化的苯乙烯作为聚合单体时可以引入尽量多的功能基，因此选择交联度为45%。

2.3 致孔剂含量的影响

固定交联度为45%，二甲亚砜占致孔剂的比例为20%，考察了致孔剂含量(50%～75%)的影响。结果表明，随着致孔剂含量的降低，孔径与粒径均明显减小。这是由于随着致孔剂含量的降低，单体与交联剂的含量逐渐增大，反应初期的聚合物种子越多，最终导致孔径与粒径均明显减小。当致孔剂含量为66%时，对小分子的苯系物和大分子的蛋白质样品均有较好的分离效果。

2.4 优化的实验结果及讨论

综合上述实验结果，通过对比不同配比合成的整体柱在分离烷基苯同系物及蛋白时的柱效评价其分离效果，发现聚合混合物的苯乙烯 ∶二乙烯苯 ∶二甲亚砜 ∶十二醇的体积比为18.7∶15.3∶13.2∶52.8时为最优配比，此时，二甲亚砜占致孔剂的比例为20%，交联度为45%，致孔剂含量为66%。对采用此配比制得的整体柱进行表征测试。

孔径分布：整体柱的整体形貌(200倍放大)、管壁与柱体键合层(2 000倍放大)、双孔结构(5 000倍放大)与粒度分布(2 000倍放大)如图3所示。结果表明，所制得的整体柱管壁与柱体键合良好，存在大孔与小孔结构，基于此双孔结构可以实现物质的分离。

图3 整体柱的SEM图Fig.3 SEM photographs of the monolithic columnA：macrocosm(×200)；B：bonding layer(×2 000)；C：dual pore structure(×5 000)；D：distribution of the particle(×2 000)

用甲苯、分子量分别为5 000、2 000 00、2 000 000的聚苯乙烯标准品进行ISEC测试，结果表明，该整体柱大孔网络占总孔隙的比例近100%,因此柱压很低。

通透性：考虑到柱子可能的承受能力，控制流速在0～300 μL·min-1内变化，结果表明，流速在0～300 μL·min-1范围内与柱压呈线性关系。说明此整体柱结构均一、通透性好、机械性能稳定。

分离性能：分离苯系物和蛋白质的实验结果如图4所示。在苯系物的分离实验中，以正丙苯分离为例，流速在13～78 μL·min-1范围内变化，柱效分别为3 350、1 702、1 230、1 263、1 110、952 N/m；在蛋白质分离实验中，以分离细胞色素C为例，在流速39～104 μL·min-1范围内，柱效分别为38 451、25 045、30 308、24 641、14 926 N/m。结果表明，随着流速的增大，分离时间缩短。在高流速下，对蛋白的分离效果依然很好，而对苯系物的分离有一定影响。

图4 不同流速下对苯系物(A)和蛋白(B)的分离Fig.4 Chromatograms of benzenes(A) and proteins(B) on monolithic columnA.column dimension,200 mm×0.530 mm;mobile phase,ACN-H2O(70∶30,by volume;UV at 254 nm;peaks:1.sulfourea;2.benzene;3.toluene;4.phenylethane;5.n-proplbenzene;6.n-butylbenzene;7.amylbenzene;B.column dimension,200 mm×0.530 mm;mobile phase,ACN-H2O system with different volume ratios,containing 0.1% trifluoroacetic acid;UV at 214 nm;peaks:1.ribonuclease A;2.benzene;3.myoglobin

在26 μL·min-1(线速度约为3 mm· s-1)流速下等度分离正丙苯的柱效达1 686 N/m(图5A)；改变梯度洗脱条件，在104 μL·min-1(线速度约为12 mm·s-1)流速下梯度分离细胞色素C的柱效达到36 868 N/m，与图4B的结果对比可知，分析时间进一步缩短(图5B)。

图5 对苯系物(A)和蛋白(B)的快速分离Fig.5 Chromatograms of benzenes(A) and proteins(B) on monolithic column the conditions and peak numbers denoted were the same as Fig.4

结果表明，此整体柱实现了对苯系物与蛋白的快速分离。其中蛋白分离实验的流速达104 μL·min-1，线速度约为12 mm·s-1，而常规色谱柱的线速度为1～2 mm·s-1。此整体柱渗透性好，可用于物质的高速分离。

3 结 论

本文首次以二甲亚砜/正十二醇为二元致孔剂用于整体材料的合成。所制备的整体柱对小分子与大分子均有良好的分离效果，其通透性好，柱压降小，可用于快速分离物质，为毛细管整体柱的制备提供了新的思路。采用带反应基团的苯乙烯衍生物进行聚合，再经过柱上化学修饰，或直接采用带功能基的苯乙烯衍生物进行整体聚合，可得到带有不同功能基的聚苯乙烯整体柱，有望用于其它色谱分离模式。本研究中制备条件对柱结构与性能的影响规律，对将来更深层的研究具有参考意义。

致谢：非常感谢厦门大学王秋泉教授以及广东省测试分析研究所(中国广州分析测试中心)付强博士的指导和帮助。

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Preparation and Characterization of a PS-DVB Monolithic Column Using Dimethylsulfoxide/Dodecanol as Binary Porogenic Agent

XU Han-qiu*

(Inspection of Products Quality of Longyan City,Longyan 364000,China)

A novel styrene-divinylbenzene copolymer monolithic capillary column was prepared using dimethylsulfoxide/dodecanol as binary porogenic agent.The polymer was prepared with styrene as monomer,divinylbenzene as crosslinker,benzoperoxide as initiator.In order to optimize the properties,the contents of the polymerized mixtures were investigated.Key variables such as composition of porogenic agent and crosslinking degree and content of porogenic agent in the mixtures could be controlled easily during the on-column polymerization.The PS-DVB monolithic column was characterized by scan electric microscopy(SEM),inverse size exclusion chromatography(ISEC),and measured under back pressure at different flow rates to evaluate the porous properties.Homologous compounds of benzene and some proteins were used as objective probes in reverse phase chromatography mode for evaluating the separation performance of the synthesized column.The optimum preparation conditions were as follows:the volume ratio of styrene and divinylbenzene and dimethylsulfoxide and dodecanol was 18.7∶15.3∶13.2∶52.8,that is,the content of dimethylsulfoxide in binary porogenic agent occupied 20%,the degree of crosslinking tooked up to 45% and the content of binary porogenic agent reached to 66%.The flow rate reached to 104 μL·min-1in the experiment for the separation of protein,and the line speed was about 12 mm·s-1,while the conventional speed was about 1-2 mm·s-1.With the advantage of excellent chromatographic separation efficiency for biological macromolecules,the monolithic capillary column could be available in other separation modes if it is chemically modified.

binary porogenic agent;styrene-divinylbenzene;reverse phase chromatography;dimethylsulfoxide;capillary;monolithic column;high speed separation

O652.63

:A

：1004-4957(2017)09-1139-06

2017-03-30；

：2017-05-18

*

：许涵秋，工程师，研究方向：分析化学，Tel：0597-3292395，E-mail：Rachelogo@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.09.015