王明娟，周晓慧，刘 超

长链非编码RNA-HOTAIR对子宫内膜癌转移侵袭能力的影响

王明娟1，周晓慧2，刘 超3

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)-HOTAIR对子宫内膜癌细胞增殖和侵袭转移等生物学行为调控作用的影响。方法收集子宫内膜癌组织标本20例、增生子宫内膜组织标本20例、正常子宫内膜组织标本10例，采用RT-PCR检测lncRNA-HOTAIR在正常子宫内膜组织、增生子宫内膜组织及各期子宫内膜癌组织中的差异表达；利用脂质体Lipofectamine 2000将HOTAIR-siRNA转染Ishikawa细胞；分别采用MTT实验检测各组细胞增殖能力、Transwell小室实验对各组细胞迁移和侵袭能力进行检测。结果与正常子宫内膜组相比，lncRNA-HOTAIR在各期子宫内膜癌组的基因表达水平显著升高(P<0.05)；lncRNA-HOTAIR在单纯性增生子宫内膜组、不典型性增生子宫内膜组的表达水平，差异无显著性(P>0.05)。HOTAIR-siRNA靶向抑制组的细胞增殖水平、侵袭能力与迁移能力显著低于空白对照组与阴性对照组(P<0.05)。结论lncRNA-HOTAIR参与子宫内膜癌的发生、发展，可能在子宫内膜癌的转移侵袭中起重要作用。

子宫肿瘤；子宫内膜癌；lncRNA-HOTAIR；siRNA；迁移与侵袭

子宫内膜癌是女性最常见的生殖系统恶性肿瘤，近年在全球范围内发病率呈上升趋势[1-3]，严重威胁妇女生命和健康。15%～25%的子宫内膜癌患者就诊时已经为晚期，大多数子宫内膜癌患者预后较差[4]，患者的子宫外转移与其预后明显相关，子宫内膜癌的发生、发展和转归是一个极其复杂的多阶段、多基因调控异常的过程[5]，是癌基因激活与抑癌基因失活共同作用的结果。长链非编码RNA(lncRNA)的表达紊乱参与多种疾病的发生、发展，尤其在肿瘤的发生中起重要作用[6]。HOTAIR是个已知的通过反式作用调节基因表达的lncRNA，长度为2 158 bp，目前HOTAIR在乳腺癌、食管癌、肝癌等多种肿瘤的研究中取得一定进展，并且与肿瘤的转移及预后密切相关[7]。本实验采用RT-PCR、MTT、Transwell小室法旨在探讨HOTAIR与子宫内膜癌细胞增殖和转移侵袭的相关性，对HOTAIR在子宫内膜癌中的作用进行初步分析，为子宫内膜癌的治疗及预后评价提供实验依据[8]。

1 材料与方法

1.1材料收集承德医学院附属医院妇科2013年1月～2014年12月子宫组织50例，分别为正常子宫内膜组织10例、单纯性增生子宫内膜组织10例、不典型增生子宫内膜组织10例及各期子宫内膜癌组织20例(其中子宫内膜癌Ⅰ期10例、子宫内膜癌Ⅱ期5例、子宫内膜癌Ⅲ期5例)。患者均签署知情同意书，子宫内膜癌患者术前均未接受放、化疗或性激素治疗，所有病例均无其他恶性肿瘤。将新鲜组织于组织离体后30 min内取材，置于经RNA酶灭活的无菌冻存管中，液氮速冻4 h，-80 ℃冰箱储存备用。

1.2试剂人子宫内膜癌细胞株Ishikawa购于凯基生物公司，RT-PCR引物由上海生物公司合成；RNA提取试剂盒购自Omega公司；转染试剂脂质体Lipofectamine 2000、Trizol均购自 Invitrogen公司；反转录试剂盒和PCR试剂盒，购自大连宝生物公司；DMEM培养基购自Gibco公司；MTT购自Sigma公司；Transwell小室购自Corning公司。

1.3方法

1.3.1细胞培养 人子宫内膜癌Ishikawa细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃ 5% CO2，饱和湿度的培养箱中培养。

1.3.2总RNA提取及RT-PCR检测 采用Trizol法提取RNA，提取细胞中的RNA时，细胞(1～5)×107个加入1 mL Trizol。提取组织样本RNA时，取-80 ℃保存的新鲜组织100 mg，研磨后加入1 mL Trizol，再次研磨混匀后提取RNA，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。用核酸定量仪测定其纯度和浓度，根据反转录试剂盒操作说明进行反转录合成cDNA，以cDNA作为模板进行PCR特异性扩增，检测lncRNA-HOTAIR和内参GAPDH的基因表达。HOTAIR引物序列：上游5′-GGTAGAAAAAGCAACCACGAAGC-3′，下游5′-ACATAAACCTCTGTCTGTGAGTGCC-3′；GAPDH引物序列：上游5′-GAATGGGCAGCCGTTAGGAA-3′，下游5′-GGTCATTGATGGCAACAATAT-3′。反应条件为预变性：94 ℃ 2 min，变性：94 ℃ 30 s，退火：62 ℃ 30 s，延伸：72 ℃ 20 s，延伸：10 ℃ 10 min，30个循环。应用Quantity One软件进行定量分析，以目的条带光密度与GAPDH条带光密度的比值，作为各目的基因表达的相对水平。

1.3.3特异干扰RNA(siRNA)抑制lncRNA-HOTAIR的表达 应用HOTAIR特异性siRNA(上海吉玛公司设计合成)的序列信息如下。siRNA1：正义5′-GCACAGAGCAACUCUAUAATT-3′，反义5′-UUAU AGAGUUGCUCUGUGCTT-3′；siRNA2：正义5′-GAGG CGCUAAUUAAUUGAUTT-3，反义5′-AUCAAUUAAU UAGCGCCUCTT-3′；siRNA3：正义5′-GCUAAGGA AAGAUCCAAAUTT-3′，反义5′-AUUUGGAUCUUUC CUUAGCTT-3′；阴性对照：正义5′-UUCUCCGAAC GUGUCACGUTT-3′，反义5′-ACGUGACACGUUCGG AGAATT-3′。利用Lipofectamine 2000将siRNA转染至Ishikawa细胞，细胞密度每毫升1×105个。(1)设空白对照组：子宫内膜癌细胞Ishikawa；(2)阴性对照组：在Ishikawa细胞中转染空白序列；(3)实验组：在Ishikawa细胞中转染特异HOTAIR-siRNA序列siRNA1、siRNA2、siRNA3的终浓度50 nmol/L，转染48 h后采用RT-PCR检测siRNA对HOTAIR的抑制率。

1.3.4MTT法检测细胞的增殖水平 分别取200 μL的空白对照组、阴性对照组、实验组中HOTAIR-siRNA3细胞，接种至96孔培养板中，每组设置3个复孔。48 h终止培养，终止培养前4 h每孔需加入20 μL MTT,使其终浓度为5 mg/mL。培养完毕后吸除孔内液体，并加入200 μL DMSO。用酶标仪测定在570、630 nm波长下的光密度值(OD)，其中以OD630作校准；细胞活力用OD570表示。每组实验重复3次，取平均值。

1.3.5细胞体外迁移和侵袭实验 侵袭实验：用无血清DMEM培养基稀释Matrigel，每孔使用100 mL Matrigel包被Transwell小室。分别取空白对照组、阴性对照组、HOTAIR-siRNA3组各200 μL细胞悬液(含1%胎牛血清 DMEM)加入Transwell小室的上室中(细胞密度为每毫升1×105个)，将含20%胎牛血清DMEM培养液500 μL加入下室中，每组设3个复孔，实验重复3次。将Transwell小室板转移至37 ℃ 5%CO2的培养箱中培养36 h。取出Transwell小室，用干净的棉签擦去上室表面的细胞及Matrigel，PBS冲洗2次，用甲醇固定30 min，然后用0.1%结晶紫染色30 min，纯水清洗，显微镜下计数至少5个高倍视野穿膜的细胞，计算每个视野平均穿膜细胞数，作为评价细胞侵袭能力的指标。迁移实验：除不在Transwell小室中包被Matrigel，其余步骤同侵袭实验。

2 结果

2.1HOTAIR在正常、增生子宫内膜和子宫内膜癌组织中的表达与正常子宫内膜组相比，单纯性子宫内膜增生组、不典型子宫内膜增生组中HOTAIR基因的表达水平，差异均无显著性(P>0.05)。与正常子宫内膜组相比，子宫内膜癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期中HOTAIR基因的表达水平均显著升高(P<0.05)，提示HOTAIR的高表达与子宫内膜癌的发生、发展有关(图1)。

图1 HOTAIR在正常、增生子宫内膜及子宫内膜癌组织中的表达

1.Marker；2.正常子宫内膜；3.单纯性子宫内膜增生；4.不典型子宫内膜增生；5.子宫内膜癌Ⅰ期；6.子宫内膜癌Ⅱ期；7.子宫内膜癌Ⅲ期

2.2特异siRNA抑制lncRNA-HOTAIR的表达分别收集空白细胞、阴性对照、HOTAIR-siRNA1、HOTAIR-siRNA2、HOTAIR-siRNA3各组细胞，提取总RNA。采用RT-PCR法检测特异siRNA对HOTAIR基因表达的抑制率。结果显示：与空白细胞组比较，阴性对照组HOTAIR基因的表达水平差异无显著性(P>0.05)；与阴性对照组比较，HOTAIR-siRNA1、HOTAIR-siRNA2、HOTAIR-siRNA3组中HOTAIR基因的表达水平均显著降低(P<0.05)；通过比较3组中HOTAIR基因的表达水平发现，HOTAIR-siRNA1组与HOTAIR-siRNA2组基因的表达水平差异无显著性(P>0.05)；与HOTAIR-siRNA1组相比，HOTAIR-siRNA3组基因的表达水平显著降低(P<0.05)；与HOTAIR-siRNA2组相比，HOTAIR-siRNA3组基因的表达水平显著降低(P<0.05)，提示HOTAIR-siRNA3干扰性最强，本组将其作为后续实验的干扰条件(图2)。

1.Marker；2.HOTAIR-siRNA1；3.HOTAIR-siRNA2；4.HOTAIR-siRNA3；5.阴性对照；6.空白对照

2.3MTT法检测各组细胞增殖水平MTT实验结果显示：与空白对照组比较，阴性对照组细胞的增殖能力无明显改变(P>0.05)；与阴性对照组比较，HOTAIR-siRNA3组细胞的增殖能力显著减弱(P<0.05，图3)。

2.4Transwell小室实验检测细胞侵袭和迁移能力

2.4.1细胞侵袭实验 与空白对照组比较，阴性对照组穿膜细胞数差异无显著性(P>0.05)；与阴性对照组比较，HOTAIR-siRNA3组穿膜细胞数显著减少(P<0.01，图4、5)。

2.4.2细胞迁移实验 与空白对照组比较，阴性对照组穿膜细胞数无明显差异(P>0.05)；与阴性对照组比较，HOTAIR-siRNA3组穿膜细胞数显著减少(P<0.01，图6、7)。

图3 比较各组细胞增殖水平与阴性对照组比较，*P<0.05

ABC图4 细胞侵袭实验:A.空白对照组;B.阴性对照组;C.HO-TAIR-siRNA3组

图5 HOTAIR-siRNA对子宫内膜癌细胞侵袭能力的影响与阴性对照组比较，*P<0.01

图6细胞迁移实验：A.空白对照组；B.阴性对照组；C.HOTAIR-siRNA3组

图7 HOTAIR-siRNA对子宫内膜癌细胞迁移能力的影响与阴性对照组比较，*P<0.01

3 讨论

子宫内膜癌是妇科肿瘤最常见的恶性肿瘤，位居女性生殖道恶性肿瘤的首位，主要原因可能是高级别肿瘤(如浆液性腺癌)、晚期和老年患者的增长[9]。由于大多数子宫内膜癌具有基因突变，因此从分子层面上探索子宫内膜癌的发病机制及与子宫内膜癌转移侵袭的分子机制，将为子宫内膜癌的预后评估和基因治疗寻找新的靶点。

lncRNA是长度大于200 nt的RNA，其本身不具有编码蛋白的功能，以RNA的形式从多种层面上调控基因的表达。lncRNA可通过RNA与蛋白质的相互作用、RNA与DNA、RNA与RNA的相互作用方式，从表观遗传修饰、转录及转录后等多个层面调控基因表达[10]。

近年关于lncRNA功能的研究进展迅速，但绝大部分lncRNA的功能尚未明确[11]。只有少部分 lncRNA的生物学功能得到验证，尽管文献报道较少，但lncRNA在恶性肿瘤等人类疾病的治疗和诊断中具有重要的潜在应用前景。

lncRNA-HOTAIR位于人类12号染色体HOHC基因座，属于典型的反义lncRNA，主要通过反式作用沉默染色质。大量研究证实，HOTAIR在乳腺癌、食管癌、肝癌等多种实体瘤中均高表达，且与肿瘤细胞的侵袭转移、肿瘤复发、不良预后等均密切相关[7]。Gucta等[12]证实HOTAIR在原发性与转移性乳腺癌组织中均显著表达，且在转移灶中HOTAIR表达水平高出正常上皮组织200～2 000倍，进一步分析发现，雌二醇可诱导HOTAIR的转录，提示HOTAIR转录启动子区域存在雌二醇的功能反应元件。体外实验证实，HOTAIR在食管鳞癌细胞系中KYSE30细胞株的表达水平较高，采用siRNA技术敲低HOTAIR，可显著降低KYSE30细胞转移和侵袭能力，并显著增加细胞凋亡率。HOTAIR已被发现[13]在多种肿瘤细胞中调节VEGF、MMP-9蛋白及EMT相关基因，增强肿瘤生物学行为，促进肿瘤转移， HOTAIR缺失可减缓细胞增殖，降低MMP及VEGF蛋白表达。本组探讨正常子宫内膜、增生子宫内膜及子宫内膜癌组织中HOTAIR的表达，结果显示：与正常子宫内膜组比较，单纯性子宫内膜增生组、不典型子宫内膜增生组中HOTAIR基因的表达水平差异均无显著性(P>0.05)；与正常子宫内膜组比较，子宫内膜癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期中HOTAIR基因的表达水平均显著升高(P<0.05)，表明lncRNA-HOTAIR的表达水平与子宫内膜癌的发生、发展密切相关。

本实验通过特异siRNA靶向抑制子宫内膜癌细胞HOTAIR的表达，采用MTT细胞增殖实验、Transwell小室实验，分析子宫内膜癌细胞中HOTAIR的表达水平与子宫内膜癌转移侵袭的相关性。结果显示：通过转染HOTAIR-siRNA，能够有效抑制HOTAIR在细胞中的表达水平。在HOTAIR-siRNA靶向抑制组中，MTT实验显示细胞增殖能力明显下降；Transwell实验表明，HOTAIR表达被抑制后，子宫内膜癌细胞的迁移和侵袭能力明显下降，推测HOTAIR的高表达与子宫内膜癌的发生、发展及侵袭转移恶性生物学行为密切相关。

综上所述，HOTAIR的高表达将促进子宫内膜癌细胞的转移和侵袭，可能与子宫内膜癌的不良预后有关，提示其具有高度的转移风险。因此，HOTAIR有望成为子宫内膜癌预后评价的生物学标志物及基因治疗的新靶点。

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Influenceoflongchainnon-codingRNA(lncRNA)-HOTAIRonmigrationandinvasionabilityofendometrialcancer

WANG Ming-juan1, ZHOU Xiao-hui2, LIU Chao3

(1MorphologyExperimentalCenter,2DepartmentofBiochemistry,BasicMedicalCollege,ChengdeMedicalUniversity,Chengde067000,China;3DepartmentofCardiovascular,AffiliatedHospitalofChengdeMedicalUniversity,Chengde067000,China)

PurposeTo investigate the influence of long chain non-coding RNA (lncRNA)-HOTAIR on endometrial cancer cell proliferation, invasion, metastasis and other biological behaviour.Methods20 cases of endometrial carcinoma tissue specimen, 20 cases of hyperplasia tissue sample and 10 cases of normal tissue specimen were collected. Difference expression of lncRNA-HOTAIR in normal endometrium, hyperplasia endometrium tissue and endometrial carcinoma tissue at all periods were detected with RT-PCR assay. HOTAIR-siRNA transfection into Ishikawa cells was utilized with Lipofectamine 2000. MTT experiment was used to detected the proliferation ability of cells in all groups. Transwell chamber experiment was used to test the migration and invasion ability of cells in all groups.ResultsThe gene expression level of of lncRNA-HOTAIR in endometrial carcinoma group at all stages was prominently increased compared with normal endometrium group (P<0.05). The expression level of lncRNA-HOTAIR in simple hyperplasia endometrium group and atypical hyperplasia endometrial group was not significantly different (P>0.05). Cell proliferation, invasion ability and migration ability of HOTAIR-siRNA targeting suppression group were lower than the blank control group and the negative control group significantly (P<0.05).ConclusionlncRNA-HOTAIR may involved in occurrence and development of endometrial cancer, which may play an important role in the aggression and metastasis of endometrial cancer.

endometrial neoplasm； endometrial cancer； lncRNA-HOTAIR； siRNA； migration and invasion

时间：2017-7-18 11:51 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1151.007.html

河北省卫生计生委(ZD20140070)

1承德医学院基础医学院形态学实验中心、2生化教研室，承德 067000

3承德医学院附属医院心脏内科，承德 067000

王明娟，女，硕士，实验师。E-mail： 1390027337@qq.com

R 737.33

:A

:1001-7399(2017)07-0737-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.007

接受日期：2017-05-27