章龙玉，魏兆莲，徐福霞

自噬基因LC3在子宫内膜异位症中的表达及其意义

章龙玉1，魏兆莲2，徐福霞1

目的探讨细胞自噬状态与子宫内膜异位症之间的关系及其意义。方法对子宫内膜异位症患者在位及异位内膜基质细胞(n=31)及正常子宫内膜基质细胞(n=31)行原代培养，进行免疫细胞化学鉴定；应用透射电镜观察组织中细胞自噬泡超微结构变化；采用RT-PCR、Western blot法检测LC3 mRNA和蛋白的表达。结果透射电镜结果显示：子宫内膜在位及异位内膜细胞的自噬泡数目较少。RT-PCR及Western blot法结果显示：子宫内膜异位症患者在位及异位内膜的LC3 mRNA及蛋白的表达水平明显低于正常子宫内膜(P<0.05)。子宫内膜异位症患者在位与异位内膜的LC3 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)，而异位内膜的LC3蛋白表达水平高于在位内膜(P<0.05)。结论子宫内膜异位症患者的在位及异位内膜基质细胞的自噬活性降低，自噬可能参与子宫内膜异位症的发生。

细胞自噬；子宫内膜异位症；LC3

子宫内膜基质和腺体出现在子宫体以外的部位称为子宫内膜异位症(endometriosis, EMT)，由具有生长功能的异位内膜所致。因EMT导致的痛经、不孕等严重影响育龄妇女的健康，其发病机制尚不明确。EMT与肿瘤疾病有许多共性，如转移、种植、复发等。已明确细胞自噬的活性在多种肿瘤疾病中有所改变[1-2]。细胞自噬的形成与多种自噬因子有关，LC3是重要的细胞自噬因子[3]。目前，国内外对EMT在位及异位内膜细胞的自噬泡超微结构及LC3与EMT的相关性报道较少。本文着重探讨细胞自噬状态与EMT之间的关系及其意义，提高人们对其的认识水平。

1 材料与方法

1.1临床资料收集安徽医科大学第一附属医院妇科EMT合并单侧或双侧巧克力囊肿并行巧囊剥除术的患者31例，平均年龄(32.48±4.36)岁。术前用一次性内膜吸引器吸取少量子宫内膜，术后立即分离巧囊囊壁，30 min内进行分离培养操作。另收集因输卵管不通不孕或正常女性患者合计31例正常子宫内膜，患者平均年龄(32.39±2.64)岁。女性行输卵管通液术或造影术前用一次性内膜吸引器吸取少量子宫内膜，处理方法同上。所有患者均在月经干净后3～7天进行手术，选取增生期的子宫内膜，由病理医师诊断确诊。所有患者月经正常，均无内科合并症，术前6个月内未行激素类药物治疗，所有患者在采集标本前均被告知，并签署知情同意书。

1.2主要试剂胶原酶Ⅰ购自美国Sigma公司；vimentin抗体购自上海科敏公司；CK抗体购自北京博奥森公司；逆转录试剂盒为美国Promega公司产品；LC3抗体(SC-271625)购自美国Santa Cruz公司；SP试剂盒购自北京中杉金桥公司。

1.3方法

1.3.1子宫内膜基质细胞的原代分离培养及免疫细胞化学鉴定 将选取好的子宫内膜组织及异位内膜组织用D-hanks反复冲洗后，剪碎组织至大小1 mm3。根据文献[4]提供的方法分离EMT在位子宫内膜及异位子宫内膜基质细胞，进行原代细胞培养。采用免疫细胞化学SP法鉴定培养获得的子宫内膜基质细胞，对于一抗的稀释，进行预试验后采用Anti-vimentin：1 ∶200、Anti-CK19：1 ∶200。次日室温条件下添加二抗(生物素标记小鼠抗人IgG)，DBA显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，中性树胶封固，于80 ℃烤箱烤干。分离纯化的子宫内膜基质细胞以备后用。

1.3.2透射电镜样品制备 将刚离体的组织切割至1 mm3大小，经2.5%戊二醛固定，脱水，包埋，固化，超薄切片，枸橼酸铅染色，透射电镜观察拍片。

1.3.3RT-PCR检测LC3 mRNA的表达水平 采用Trizol提取液抽提细胞中的RNA，采用逆转录试剂盒将总RNA中的信使RNA(mRNA)反转录为cDNA，取cDNA标本按下列比例配置PCR反应体系：2×Goldstar混合物10 μL；上游引物：0.4 μL(10 μmol/L)；下游引物：0.4 uL(10 μmol/L)；模板DNA 2 μL；无RNA酶水7.2 μL。按照下列程序进行PCR反应：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，重复40个循环。得到扩增曲线后读取Ct值，计算mRNA含量。引物如下：GAPDH上游5′-GCCGCAT CTTCTTTTGCGTC-3′，下游5′-TACGACCAAATCCGT TGACTCC-3′；LC3上游5′-TCAGACCGGCCTTTCAA GCA-3′，下游 5′-CTCGATGATCACCGGGATTTTG-3′；以GAPDH作为内参。

1.3.4Western blot检测LC3蛋白的表达水平 将原代培养的细胞悬液1 000 r/min×5 min，加入含有1 μmol/L PMSF的RIPA细胞裂解液，进行12 000 r/ min×5 min。细胞总蛋白于上清液内。取上清，蛋白定量后分装，-80 ℃冻存备用。SDS-PAGE电泳：SDS-PAGE凝胶配制、样品处理、上样与电泳、转膜、封闭、一抗、二抗孵育。具体操作步骤按试剂盒说明书进行，使用ECL发光试剂盒检测蛋白表达。

2 结果

2.1子宫内膜基质细胞原代培养子宫内膜基质细胞(图1)及异位内膜基质细胞按照上述的分离纯化方法，置于显微镜下观察并摄片。可见镜下细胞排列不规则，呈中间粗大、两边细小的纺锤体，排列无规则，生长状态良好。

2.2子宫内膜基质细胞免疫细胞化学的鉴定子宫内膜基质细胞镜下大部分呈纺锤体，少部分呈三角形，细胞边缘不清晰，排列无规则。子宫内膜基质细胞CK19呈阴性(图2A)，vimentin呈阳性(图2B)，其细胞质呈棕黄色颗粒。随机取5个视野(×100)，vimentin着色细胞即基质细胞比例为95%以上。

2.3正常子宫内膜组织和EMT在位及异位内膜组织中细胞自噬泡超微结构的变化正常子宫内膜组织获得5例切片，EMT在位及异位内膜组分别获得5例切片。结果显示：EMT在位及异位内膜中自噬溶酶体的数量无明显差别，其自噬溶酶体的数量明显少于正常子宫内膜组织。自噬体表现为胞质内游离的单层或双层膜结构包绕胞质或损伤细胞器形成的囊泡状结构(图3)。

2.4LC3mRNA在正常子宫内膜基质细胞和EMT在位、异位内膜基质细胞中的表达运用RT-PCR检测LC3 mRNA在EMT在位及异位内膜组与正常子宫内膜组的表达。结果显示：LC3 mRNA在EMT在位及异位内膜基质细胞中表达均低于正常子宫内膜组(F=4.438，P=0.015)。EMT在位子宫内膜基质细胞的LC3 mRNA与正常子宫内膜组相比其表达下调(0.435±0.227，P=0.013)，EMT异位子宫内膜基质细胞的LC3 mRNA表达量与正常子宫内膜组相比其表达也下调(0.429±0.303，P=0.011)，但EMT在位及异位内膜基质细胞的LC3 mRNA表达量差异无显著性(1.282±0.534，P=0.949)。提示EMT不管在位及异位内膜基质细胞的LC3 mRNA表达水平均明显低于正常子宫内膜组(图4)。

2.5LC3蛋白在正常子宫内膜基质细胞和EMT在位、异位内膜基质细胞中的表达运用Western blot法检测LC3蛋白在EMT在位及异位内膜组与正常子宫内膜组中的表达。结果显示：LC3蛋白在EMT在位及异位内膜的基质细胞中表达均低于正常子宫内膜组(P=0.000)。EMT在位子宫内膜基质细胞的LC3蛋白与正常子宫内膜组相比其表达下调(0.242±0.08，0.440±0.08；P=0.000)。EMT异位子宫内膜基质细胞中LC3蛋白表达量比正常子宫内膜组相比其表达也下调(0.309±0.09，P=0.000)；EMT异位内膜基质细胞中LC3蛋白表达量明显高于在位内膜组(P=0.003)，与RT-PCR的实验结果基本相符(图5)。

①②A②B③A③B③C

图1正常子宫内膜基质细胞图2子宫内膜基质细胞，SP法：A.CK19呈阴性；B.vimentin呈阳性图3A.正常子宫内膜细胞自噬泡超微结构；B.EMT中在位内膜细胞自噬泡超微结构；C. EMT中异位内膜细胞自噬泡超微结构

图4 EMT在位及异位内膜基质细胞及正常子宫内膜基质细胞中LC3 mRNA的相对表达量

3 讨论

育龄期妇女发生EMT较为常见，其属于良性疾病，但生物学行为与恶性肿瘤有相似之处，如种植、转移、复发等。目前，EMT的发病机制存在多种学说，以经血逆流和内膜种植学说最为经典，但该学说无法解释部分经血逆流妇女为何未患EMT。研究表明[5]：肉眼观察EMT患者的在位子宫内膜与非EMT妇女的子宫内膜无明显差异，但在超微结构、免疫特性和分子活性等方面可能差异有显著性。EMT患者的在位子宫内膜的某些特性如黏附性、侵袭性、刺激形成血管的能力均较强，更易于异地生长种植。近年郎景和院士提出“在位内膜决定论”[6]，认为在位子宫内膜的生物学异常是决定因素，周围微环境则是EMT发生的影响因素。

图5 EMT在位、异位内膜组及正常子宫内膜组中LC3 蛋白的相对表达量

自噬是指在真核细胞中，细胞内自我清除周转的现象，维持细胞内蛋白质平衡及内环境的稳定。自噬参与多种病理过程，可能与心肌缺血再灌注、神经退行性疾病、肥胖症、肾脏疾病等多种疾病的发生、发展有关。自噬与肿瘤的相关性分析是近年分析地热点。环境因素可影响自噬活性，同时诸多的信号通路也对自噬进行调控，如依赖mTOR信号通路、PI3K-AKT信号通路、磷酸腺苷激活的蛋白激酶信号通路以及非依赖mTOR的信号通路等。自噬水平能够被一些癌基因抑制，如AKT1、PI3K、BCL-2家族中的抗凋亡蛋白；同时自噬又能够被多种抑癌基因激活，如LKB1/STK11、DAPK1、PTEN等。

LC3是细胞自噬的标志性蛋白，定位于前自噬泡及自噬泡表面，是自噬泡膜的标志物。LC3即为ATG8，而ATG8同系物是C末端的延伸形式，经ATG4半胱氨酸蛋白酶降解后导致C-末端甘氨酸可以缀合到磷脂酰乙醇胺上。ATG8与磷脂酰乙醇胺的共价结合导致LC3-II结合到自噬体膜上，有利于自噬体的伸展。在酵母中只存在单一的ATG8蛋白，但哺乳动物至少有7个ATG8家族成员，如LC3A-C中存在LC3A的2种异构体即GABARAP和GABARAPL1-2[3]。LC3和GABARAP亚家族成员均可结合至自噬体膜上[7-8]，基因敲除的研究表明，这两个亚族有独特的作用且均为自噬体形成所必需。LC3的同系物可结合于自噬体膜的内表面及外表面，外表面的部分被ATG4清除，而内表面的部分不会被清除而是与货物一起降解。LC3/GABARAP蛋白质可以招募各种蛋白质。

自噬对肿瘤的影响亦有不同。自噬活性的提高可能参与人肝癌细胞的发展，自噬蛋白LC3B的表达可能是肝细胞癌进展和预后不良的潜在标志物[9]。LC3的表达可促进乳腺癌的临床侵袭性行为，如淋巴结及淋巴管转移率增高和高的病理分期，抑制自噬可部分逆转乳腺癌MCF-7/ADM细胞耐药[10]。由于EMT与肿瘤有相似的生物学行为，故近年来关于自噬与EMT的报道愈加增多。Ruiz等[11]在EMT的小鼠模型中，应用细胞自噬抑制剂羟氯喹可以减弱人类子宫内膜细胞和内膜T-HESC细胞的体外生存能力，同时羟氯喹可以减少内膜异位病灶的数目和破坏病灶的组织病理学，升高腹腔内巨噬细胞和干扰素γ诱导蛋白趋化因子的水平，EMT诱导的小鼠子宫角中LC3B蛋白表达呈递增趋势，从而证明自噬在EMT的在位及异位内膜中表达失衡。Allavena等[12]证实自噬相关基因ATG14、BECN1、ATG7和LC3B的mRNA在卵巢EMT患者的异位内膜组织中的表达水平增高，子宫内膜异位细胞对凋亡和持续氧化应激的易感性降低可能有利于自噬。国内有学者报道：LC3 mRNA在异位内膜组织中的表达低于正常内膜组织；异位内膜组织与在位内膜组织相比，其表达明显下调，但在位内膜组与正常内膜组间表达无明显差异[13]。本实验在EMT内膜细胞的超微结构水平发现，其在位及异位内膜细胞的自噬活性减弱，同时在位及异位内膜细胞的LC3 mRNA及蛋白表达水平降低，与报道不完全一致，可能由于上述实验用的是内膜组织，而本实验应用的是子宫内膜基质细胞，因而本实验的结果更加准确。抑制哺乳动物mTOR蛋白可以增加卵巢子宫内膜异位囊肿异位内膜的自噬活性，哺乳动物mTOR靶蛋白异常活性导致子宫内膜细胞自噬的改变，这与异常凋亡相关[14]。在体外培养的EMT细胞系，苗勒管抑制物可以抑制细胞的增殖，诱导自噬与凋亡的发生[15]。

本实验采用细胞原代培养、免疫细胞化学、透射电镜、RT-PCR、Western blot等技术系统的分析细胞自噬与EMT的相关性。本实验中的子宫内膜基质细胞经原代细胞培养，并鉴定。透射电镜下观察超薄切片，与正常子宫内膜组织相比，EMT在位及异位内膜细胞中较少出现自噬体，提示EMT组织中的细胞自噬活动较少。EMT在位及异位子宫内膜基质细胞中LC3蛋白表达水平均明显低于正常子宫内膜组织，与RT-PCR的实验结果相符。综上所述，自噬可能参与子宫内膜异位症的发生，但其确切的机制有待深入探讨。

[1] Choi A M, Ryter S W, Levine B. Autophagy in human health and disease[J]. N Engl J Med, 2013,368(7):651-662.

[2] Mowers E E, Sharifi M N, Macleod K F. Autophagy in cancer metastasis[J]. Oncogene, 2016,12(9):1679-1680.

[3] Shpilka T, Weidberg H, Pietrokovski S, Elazar Z. Atg8: an autophagy-related ubiquitin-like protein family[J]. Genome Biol, 2011,12(7):226.

[4] 秦莉花，秦明春，李 晟，等. 人子宫内膜细胞原代体外培养方法[J]. 湖南中医药大学学报, 2007,27(3):8-10.

[5] Buck Louis G M, Hediger M L, Peterson C M，etal. Incidence of endometriosis by study population and diagnostic method: the ENDO study[J]. Fertil Steril, 2011,96(2):360-365.

[6] 王 姝，郎景和. 子宫内膜异位症患者在位子宫内膜特性研究新进展[J]. 中华妇产科杂志, 2012,47(11):868-872.

[7] Kabeya Y, Mizushima N, Yamamoto A,etal. LC3, GABARAP, and GATE16 localize to autophagosomal membrane depending on form-II formation[J]. J Cell Sci, 2004,117(Pt 13):2805-2812.

[8] Weidberg H, Shvets E, Shpilka T,etal. LC3 and GATE-16/GABARAP subfamilies are both essential yet act differently in autophagosome biogenesis[J]. EMBO J, 2010,29(11):1792-1802.

[9] 吴文涌，孟翔凌，齐 勇，等. 人肝细胞癌中LC-B和p62的表达及意义[J]. 临床与实验病理学杂志, 2016,32(4):366-369.

[10] 陈 平，吴正升，吴 强，等. 抑制自噬对乳腺癌阿霉素耐药的逆转作用[J]. 临床与实验病理学杂志, 2016,32(5):528-532.

[11] Ruiz A, Rockfield S, Taran N,etal. Effect of hydroxychloroquine and characterization of autophagy in a mouse model of endometriosis[J]. Cell Death Dis, 2016,7:e2059.

[12] Allavena G, Carrarelli P, Del Bello B,etal. Autophagy is upregulated in ovarian endometriosis: a possible interplay with p53 and heme oxygenase-1[J]. Fertil Steril, 2015,103(5):1244-1251.

[13] 刘美龄，李 萌，卢美松，等. 自噬基因LC3在卵巢子宫内膜异位症中的表达及意义[J]. 哈尔滨医科大学学报, 2015,15(2):131-135.

[14] Choi J, Jo M, Lee E,etal. Differential induction of autophagy by mTOR is associated with abnormal apoptosis in ovarian endometriotic cysts[J]. Mol Hum Reprod, 2014,20(4):309-317.

[15] Borahay M A, Lu F, Ozpolat B,etal. Mullerian inhibiting substance suppresses proliferation and induces apoptosis and autophagy inendometriosis cellsinvitro[J]. ISRN Obstet Gynecol, 2013,2013:361489.

ExpressionandclinicalsignificanceofautophagygeneLC3inendometriosis

ZHANG Long-yu1, WEI Zhao-lian2, XU Fu-xia1

(1DepartmentofObstetricsandGynecology,AnhuiNo.2ProvincePeople’sHospital,Hefei230011,China;2ReproductiveofCenter,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

PurposeTo study the relationship between autophagy and endometriosis, and its significance.MethodsThe eutopic and ectopic endometrial stromal cells from patients with endometriosis (n=31) and normal endometrial stromal cells (n=31) were cultured primarily and identified by immunocytochemistry. The ultrastructural changes of autophagic vacuoles were observed by transmission electron microscopy (TEM). RT-PCR and Western blot methods were used to detect LC3 mRNA and protein expression in endometrial cells of endometriosis patients.ResultsTEM analysis showed the number of autophagic vacuoles of eutopic and ectopic endometrial cells was fewer. RT-PCR and Western blot analysis showed that the expression of LC3 mRNA and protein in eutopic and ectopic endometrium of patients with endometriosis was significantly lower than that of the normal endometrial stromal cells (P<0.05). There was no significant difference in the expression of LC3 mRNA between eutopic and ectopic endometrium of patients with endometriosis (P>0.05), but the expression of LC3 protein in ectopic endometrium was higher than that in eutopic endometrium of patients with endometriosis (P<0.05).ConclusionAutophagy activity is downregulated in eutopic and ectopic endometrial stromal cells with endometrosis. Autophagy may be involved in the pathogenesis of endometriosis.

autophagy； endometriosis； LC3

时间：2017-7-18 11:51 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1151.006.html

1安徽省第二人民医院妇产科，合肥 2300112安徽医科大学第一附属医院生殖中心，合肥 230032

章龙玉，女，硕士，医师。E-mail: zhanglongyu8@126.com 魏兆莲，女，博士，教授，博士生导师，主任医师，通讯作者。E-mail: weizhaolian_1@126.com

R 711

:A

:1001-7399(2017)07-0732-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.006

接受日期：2017-05-20