,, , ,, ,*,志伟,*

(1.山东理工大学生命科学学院,山东淄博 255000;2.山东理工大学分析测试中心,山东淄博 255000)

基于近红外光谱定量分析牛奶中掺假的动物水解蛋白含量

范睿1,孙晓凯1,杨晨1,陈杰1,刘东武2,孔玲1,*,陈志伟1,*

(1.山东理工大学生命科学学院,山东淄博 255000;2.山东理工大学分析测试中心,山东淄博 255000)

动物水解蛋白含有大量重金属离子,摄入人体危害人体健康,因其蛋白质含量高,被不法商贩作为廉价蛋白质添加在牛奶中以提高蛋白质含量。本研究自行配制不同浓度的动物水解蛋白掺假牛奶,应用近红外光谱仪浸入式光纤扫描样品,考察建模方法、预处理方法、建模范围、主成分数及样品的异常点分析对定量分析模型的影响。结果表明:使用SG平滑处理、主成分数4、在10000～5000 cm-1使用PLS法建立了最优动物水解蛋白定量分析模型。该模型的校正均方差(RMSEC)、预测均方差(RMSEP)、相关系数(r)分别为0.115、0.305、0.983,平均回收率为104.44%。该分析模型可以用于牛奶中动物水解蛋白的快速定量分析,为牛奶的品质控制和快速定量提供参考。

牛奶掺假,动物水解蛋白,定量分析,近红外光谱

乳与人类自身的历史一样悠久,不管是人类还是其他哺乳动物,乳都是用于哺育动物婴儿的重要食物,因其富含多种蛋白和氨基酸被誉为“白色血液”。牛奶作为一种理想的营养品,随着人们生活水平的不断提升,奶制品的需求量不断增加,牛奶及其制品已经成为餐桌不可缺少的食物。但在利益的驱使下乳品掺假、掺杂屡见不鲜严重影响公共健康[1];2008年的三鹿集团毒奶粉事件及2009、2011年“皮革奶事件”引起舆论热议[2-3]。蛋白质含量作为牛奶品质的重要指标,不法商家在利益的驱使下向奶制品中非法添加含氮的物质以提高牛奶的含氮量。动物水解蛋白(hydrolysate animal protein,HAP)蛋白质含量高达90%,是一种廉价的蛋白原料。动物水解蛋白多由皮革、猪皮水解而成,该物质含有大量的重金属,摄入对人体危害极大[4]。

蛋白含氮掺假物对乳蛋白质测定有较大干扰。对于真蛋白的掺假物质的检测目前主要利用的是蛋白质的特异性及非蛋白含氮的掺假物质研究比较完善,Mauer等[4]利用近红外和中红外光谱技术测量了混入奶粉中的三聚氰胺;刘莹等[5]使用三氯乙酸-双缩脲法以排除非蛋白氮物质的干扰进行的检测,Song等[6]使用酶联免疫法、Kotowicz等[7]采用双重PCR法对羊奶中的牛奶进行检测。针对动物水解蛋白中含有特殊的L-羟脯氨酸(L-Hydroxyproline),由丹青[8]建立一种测定纯牛奶中L-羟脯氨酸的紫外分光光度法,刘婷等[9]利用高效液相离子交换色谱建立了乳粉中掺假水解动物蛋白的半定量检测方法。基于氨基酸模式赖玉婷等[10]利用柱前衍生化-高效液相色谱法建立牛奶及奶粉的氨基酸简洁模式可有效判别出牛奶及奶粉的蛋白掺假。

近红外光谱(near infrared spectroscopy,NIRS)技术是一种高效、无损、快速多组分的定性和定量分析技术,已被成功地应用于石油[12]、食品[13-14]、医药[15]、农业[15]等各个领域。本实验配制不同梯度的动物水解蛋白掺入牛奶样品,使用近红外光谱仪浸入式光纤对不同梯度的掺假样本采集近红外光谱,然后结合TQ软件进行光谱的处理、建模工作。探索动物水解蛋白近红外定量分析模型,以期为牛奶的品质控制和快速定量提供参考。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

蒙牛纯牛奶(批号:1P20160720AQ0321:52) 购于淄博大润发超市;动物水解蛋白(批号:20160315) 由河南巧手食品添加剂有限公司提供;实验用水 为实验室自制去离子水。

Nicolet-6700傅里叶变换近红外光谱分析仪 (配有Antaris透射分析和光纤分析系统) 美国Thermo Scientific公司;ST 16R低温冷冻离心机 美国Thermo Scientific公司;BSM 220.4电子天平(0.0001 g) 上海卓精电子科技有限公司;SY-5200台式超声波清洗机 上海声源超声波仪器设备有限公司;HH-4数显恒温水浴锅 金坛市鑫鑫实验仪器有限公司;78-1磁力加热搅拌器 上海上登实验设备有限公司;Ominic8.2.0.387光谱处理软件、TQ Analyst8.0.0.245建模软件 美国Thermo Scientific公司。

1.2实验方法

1.2.1 制备动物源水解蛋白掺假牛奶样品 为了建立动物源水解蛋白掺假牛奶近红外定量分析模型,同时为了扩大样本的适用性和代表性,精确称量动物水解蛋白粉末于样品瓶中,制备含量0.01～2.00 g/mL的动物源水解蛋白掺假牛奶样品。实验设计41个梯度1个空白样品共计42个掺假样品。加入37 ℃水浴10 min后的牛奶100 mL,超声振荡2 min待用。为了保留标准牛奶的各项原始浓度,本实验对合格牛奶样品和掺假牛奶样品均未做稀释处理。具体配制比例见表1。

表1 牛奶中动物水解蛋白含量配比Table 1 List of the addition of hydrolysate animal protein in milk

1.2.2 近红外光谱采集 掺假样品在测试前37 ℃水浴10 min,仪器开机预热30 min,使用近红外光谱仪SabIR漫反射光纤采集近红外光谱,设置扫描范围为10000～4000 cm-1,Attenuator选择Empty,Gain选择1×,采样间隔8 cm-1,采样次数32次,采用扣除内置参考背景。

1.2.3 近红外定量分析模型建立 Ominic对样品近红外光谱处理后使用TQ Analyst进行模型建立和分析。对模型的验证集和校正集进分布、不同建模方法、不同预处理方法、建模波段范围、主成分数进行优化分析,使用马氏距离法(Mahalanobis Distance Method,MD)进行异常点判别。

2 结果与分析

2.1动物水解蛋白掺假牛奶近红外光谱图

采用扣除内置参考背景,选择Attenuator选择Empty,Gain选择1×,采样分辨率8 cm-1,采样次数32次,在10000～4000 cm-1范围内使用SabIR漫反射光纤采样品的近红外光谱。为了减少仪器的漂移每一次采集红外光谱都采集扣除内置背景,动物水解蛋白掺假牛奶近红光谱图如图1所示。

图1 动物水解蛋白掺假样品的透射采集近红外光谱叠加图Fig.1 NIRS spectra of 60 hydrolysate animal protein adulteration in milk

2.2校正集和验证集的选择

应用TQAnalyst软件自动从41份掺假样品中挑选出33份具有代表性的样品作为校正集,其余8份样品作为验证集,用于动物水解蛋白含量定量分析模型建立,结果如表2所示。验证集中动物水解蛋白含量在校正集含量范围内,此校正集和验证集可用于定量分析模型的建立[14]。

表2 动物水解蛋白含量定量分析模型校正集和验证集分布Table 2 Sample distribution of calibration set and validation set of quantitative analysis model of hydrolysate animal protein in milk

2.3不同建模方法及预处理的比较

近红外光谱定量分析模型的建立属于化学计量范畴,本研究使用经典最小二乘法(Classical Least Squares,CLS)、逐步多元线性回归(Step-wise Multi Linear Rgression,SMLR)、主成分回归(Principal Component Regression,PCR)和偏最小二乘回归(Partial Least Squares,PLS)作为建模方法建立定量分析模型;为了改善光谱特征和补偿基线偏移,不同预处理的光谱预处理样品物理性质的差异会引起光谱基线和斜率等的变化,本研究通过一阶导数(Frist Derivative)、二阶导数(Second Derivative)、SG平滑(Savitzky-Golay Filter)、Norris平滑(Norris Derivative Filter)对模型进行预处理,以校正均方差(root-mean-square error of calibration RMSEC)、预测均方差(root-mean-square error of predication,RMSEP)、相关系数(correlation coefficient,r)为指标筛选建模方法。

由表3可知使用PLS为建模方法、SG平滑处理后的定量分析模型指标较好,RMSEC、r、RMSEP分别为0.161、0.967、0.560。牛奶样品属于一种胶体乳浊液其成分复杂,PLS建模方法可以有效的对光的散射及样品成分之间的干扰做出补偿,适合用于牛奶这种复杂样本的分析[15]。光谱通过SG平滑预处理,提高了性噪比,减小了随机噪音使得模型指标比较理想[16]。

表3 不同建模方法和预处理方法对漫反射采集植物水解蛋白牛奶定量分析模型的影响Table 3 Influence of different modeling methods and pretreatment methods on quantitative analysis model

2.4建模波段数影响

在建立模型时需要选择建模波段以调整模型的准确性和稳定性。根据文献报道[17-18],蛋白质中含有大量的C-H、O-H、N-H基团,在4000～5300 cm-1的合频区有强烈的吸收;在5300～7000 cm-1的一倍频区也有着较强烈的吸收;在7000～10000 cm-1的高倍频区也有着相对较弱的吸收区。结合图1的动物水解蛋白近红外图谱,综合表4中r、RMSEC、RMSEP模型性能评价指标动物水解蛋白含量定量分析模型的最佳建模波段为10000～5000 cm-1。

表4 不同光谱范围对动物水解蛋白含量定量分析模型的影响Table 4 Influence of different spectral ranges on quantitative analysis model

2.5模型主成分数的选择

在建立近红外模型时,主成分数对模型实际预测能力有很大的影响,若主成分数选择过少,就不能充分反映被测组分所产生的光谱信息,从而导致模型预测准确度下降;若主成分数选择过多,会导致过拟合现象,从而导致模型预测能力下降[19]。本研究以交叉验证均方根(Root Mean Square Error of Cross Validation,RMSECV)为指标,选取最佳的建模成分数。最终,确定用于漫反射采集动物水解蛋白含量定量分析建模选择主成分数是4。

图2 动物水解蛋白含量定量分析模型RMSECV随主成分数的变化Fig.2 RMSECV changed with change of principal component in quantitative analysis model

2.6异常点剔除

剔除模型中的异常值样品也是优化数学模型的一项技术。本研究采用传统的马氏距离法(Mahalanobis Distance Method),比较剔除异常点前后模型参数,最终漫反射采集动物水解蛋白含量定量分析模型无异常点,如图3所示。

图3 马氏距离法(MD)对动物水解蛋白含量定量分析模型中异常点分析Fig.3 Removing abnormal points of quantitative analysis model by MD

2.7定量模型的建立

通过Ominic 8.2.0.387和Origin Pro 9.0软件对近红外光谱图进行处理、TQ Analyst 8.0.0.245软件进行模型建立及IBM SPSS Statistics 20.0.0软件进行数据分析,最终采用PLS建立了漫反射采集动物水解蛋白含量定量分析模型,该模型采用SG平滑预处理降噪,建模光谱范围为10000～5000 cm-1,主成分数为4。动物水解蛋白蛋白定量分析模型RMSEC、RMSEP、r的指标分别为0.115、0.305、0.983,将8份动物水解蛋掺假样品验证集近红外图谱代入动物水解蛋白含量定量分析模型预测动物水解蛋白含量,以预测值与参考值的比值为预测回收率,该模型平均回收率为104.44%

图4 漫反射动物水解蛋白含量定量分析模型参数图Fig.4 The parameter diagram of quantitative analysis mode of peanut注:(a)RMSEC、RMSEP及相关系数图,(b)模型残差分布图。

3 结论

PLS建模方法适合动物水解蛋白掺假牛奶定量分析模型的建立,PLS可以有效的对光的散射和牛奶中复杂成分的干扰做出补偿,适合用于牛奶这样复杂的定量分析体系。

实验配制的动物水解蛋白掺假牛奶未经任何前处理,通过近红外光谱仪扫描,红外光谱通过SG平滑焦躁处理在10000～5000 cm-1光谱范围建模,选择主成分数4,使用PLS建立动物水解蛋白定量分析模型,RMSEC、RMSEP、r分别为0.115、0.305、0.983,平均回收率为104.44%相较于传统的化学检测及生物检测(酶联、氨基酸测序)具有快速、简单、无损、环保的优点。该模型精度仍然有待进一步提高,后续实验将围绕加大样品数量以提高模型精度。

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Quantitativeanalysisofhydrolysateanimalprotein(HAP)adulterationinmilkbynearinfraredspectroscopy

FANRui1,SUNXiao-kai1,YANGChen1,CHENJie1,LIUDong-wu2,KONGLing1,*,CHENZhi-wei1,*

(1.School of Life and Science,Shandong University of Technology,Zibo 255000,China;2.Analysis and Test Center,Shandong University of Technology,Zibo 255000,China)

Hydrolysate animal protein(HAP)contains a lot of heavy metal ions which are harmful to human health. Due to its high contents of protein,HAP is used to improve the protein content in milk as an inexpensive source of protein. In this study,milk samples adulterated with different gradients of HAP were prepared. Then,the samples were scanned using near-infrared spectrometer with Fiber Optic Module and the factors influencing quantitative analysis models such as modeling methods,pretreatment methods,principal components and abnormal points were investigated with TQ software. The results indicated that the root mean square error of cross(RMSEC),the root mean square error of prediction(RMSEP)and the correlation coefficient(r)of the established model was 0.115,0.305 and 0.983 respectively,the recovery was 104.44%. The model could be used in rapid quantitative analysis of HAP in milk.

adulterated milk;hydrolysate animal protein(HAP);quantitative analysis;near infrared spectroscopy

2017-01-09

范睿(1992-)，男，硕士研究生，研究方向：生物分析化学,E-mail：fan_rui@126.com。

*通讯作者:孔玲(1974-)，女，博士，副教授，研究方向：生物分析、生物化工,E-mail:klucy@sdut.edu.cn。 陈志伟(1972-)，男，博士，教授，研究方向：生物分析化学、生物统计学,E-mail:chen@sdut.edu.cn。

国家自然科学基金面上项目(31071538)；山东省自然科学基金重点项目(ZR2013FB001)；山东省大型科学仪器升级改造项目(2011SJGZ10)。

TS207.3

:A

:1002-0306(2017)16-0253-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.048