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(1.贵州大学,酿酒与食品工程学院,贵州贵阳 550025; 2.黔东南州食品药品检验检测中心,贵州凯里 556000)

贵州薏米致霉菌的分离鉴定

石庆楠1,2,曾海英1,文安燕1,黄金1,秦礼康1,*

(1.贵州大学,酿酒与食品工程学院,贵州贵阳 550025; 2.黔东南州食品药品检验检测中心,贵州凯里 556000)

从贵州霉变薏米中分离纯化霉菌菌株,通过反接种验证其致霉性并进行生物学分类鉴定。采用点植法观察霉菌在PDA培养基上的生长性状、菌落特征,在形态学鉴定基础上,辅以ITS序列扩增等分子生物学方法将菌株拟鉴定到属种。最终筛出15株霉菌,并将其中8株致霉菌鉴定到种,分别为:C1米曲霉菌(Aspergillusoryzae)、C2黑曲霉菌(Aspergillusniger)、C3构巢曲霉菌(Aspergillusnidulans)、C4烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus)、C5冠突曲霉菌(Aspergilluscristatus)、C6层生镰刀霉菌(Fusariumproliferatum)、C7木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)和C8青霉菌(Penicilliumaethiopicum)。从薏米中分离的霉菌对薏米有明显的致霉作用,推测其为薏米中主要致霉菌类型。本文为今后薏米储藏及防霉抑腐控制提供参考依据。

薏米,霉菌,分离,纯化,鉴定

薏米在我国分布广泛,资源丰富,药食兼用,具备较全面的营养保健功能[1]。目前贵州是全国最大的薏米加工和产品集散地。贵州省气候潮湿,营养物质丰富的薏米收贮期为秋冬的阴雨季节,储藏期间会受到各种微生物特别是霉菌的危害,有些真菌毒素对人体有很强的致癌作用,防止霉菌污染是储藏过程中最关键的问题之一[2]。目前对薏米霉变的研究较少,主要集中在薏米脂的药理作用研究、薏米产品的工艺研发和重金属污染评价上[3-6],而且对薏米霉变真菌的分离鉴定未达到分子水平。

传统的真菌鉴定方法对于在培养基上培养的不产孢子的真菌,无法利用形态学进行观察[7]。由于ITS序列能从属种间[8]及部分种内[9-10]水平上为真菌的分类与鉴定提供科学依据,真菌分类与鉴定研究中ITS序列分析法的应用越来越广泛[11]。Alwakeel[12]利用扩增ITS序列的方法鉴定出了导致苹果腐败的六种真菌。国内李闽真等[13]对薏米霉菌污染情况和优势种群分布进行传统生物学研究,认为薏米的霉菌主要菌群是曲霉(Aspergillus)和青霉(Penicillum)。影响薏米真菌污染的因素,除薏米本身能为真菌生长提供良好的营养基础外,还受到产地、加工方式、储藏条件等因素的影响。由于霉菌污染直接影响到薏米储藏加工的质量和安全,本文拟针对贵州地区的薏米,采用传统与现代微生物相结合的分离与鉴定技术,确定仓储薏米中的主要致霉菌株,防止或降低薏米中霉菌污染,旨在为延长储藏期及保障薏米品质提供参考依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

仓储霉变薏米 2014年产,品种为小白壳,取自贵州省安顺市、兴仁县、紫云县和晴隆县;PDA培养基 北京陆桥有限责任公司;DNA提取试剂盒 美国BIOMIGA公司;其它试剂 均为分析纯,上海博微生物科技有限公司。

YXQ-LS-75G压力蒸汽灭菌器、YXQ-LS-75G超净台、BMJ-250C霉菌培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;Optima MAX-TL离心机 美国贝克曼库尔特有限公司;Flex cycler多功能PCR仪、BIO-BEST 200E凝胶成像仪、Compact M电泳仪 德国耶拿分析仪器股份公司;GZ-380-GSI人工气候箱 韶关市广智科技设备有限公司;CX21SF1生物显微镜 奥林巴斯有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 霉菌的分离及纯化 称取25 g仓储霉变薏米于225 mL灭菌生理盐水中,充分振荡混匀得孢子悬浮液,按10倍稀释法稀释到1×10-5,取梯度稀释的菌悬液0.2 mL涂布于PDA培养基平板上,制成含菌平板[14],在(28±1) ℃条件下倒置培养3～5 d后菌落计数,用接种环挑取典型生长的单一菌落于平板上纯化培养,重复划线接种三代,得到纯菌株转移接种至PDA斜面培养基保存并编号,结合菌落形态特征进行镜检观察鉴定。

1.2.2 霉菌致霉作用验证 从PDA平板挑取适量分离菌株菌丝体接种于50 mL萨氏培养液中,28 ℃、150 r/min培养48 h。将培养菌液过滤,用血球计数板,制成浓度大约为1×106个/mL的分生孢子菌悬液,取25 mL接种于装有250 g灭菌薏米的500 mL三角瓶中,摇动三角瓶使菌悬液分布均匀,于温度28 ℃、湿度60%的人工气候培养箱中静置培养30 d。以不接种薏米为对照,观察薏米外观变化,霉变速度与霉变程度,通过观察是否与储藏薏米样品的霉变类型一致来确定它们的致霉性,从而初步选择出主要致霉菌株。

1.2.3 霉变率测定 称取100 g左右接种薏米,观察薏米外观形态,检出霉变粒进行称重法计算,霉变率计算公式:

式中:D为霉变率;M1为霉变薏米质量;M2为接种薏米质量。

1.2.4 霉菌的菌落形态鉴定 观察菌落在平板上的形态特征、菌落大小、颜色变化等,通过对固体培养基的插片培养观察隔膜、孢子囊及孢子形态,对分离纯化得到的霉菌进行初步形态学鉴定[15]。

1.2.5 分子生物学鉴定 按照DNA提取试剂盒操作说明书对霉菌基因组DNA进行提取。提取物利用PCR技术对ITS序列进行扩增,引物对合成由上海立菲生物技术有限公司完成。空白对照不加入模板,PCR反应体系(25 μL)如表1所示。配制完成后,将PCR管反应体系充分混匀后于2000 r/min离心20 s,再置于PCR仪上进行扩增。

表1 PCR反应体系Table 1 PCR reaction system

PCR扩增条件:94 ℃预变性4 min;94 ℃变性30 s,55 ℃引物退火30 s,72 ℃延伸1 min,30个循环;最后72 ℃延伸10 min。

分别取3 μL PCR产物和DNA Marker点于1%琼脂糖凝胶的点样孔中进行电泳,结束后使用凝胶成像系统进行观察,目标条带为600 bp左右,若条带单一且明亮清晰则表明扩增成功,扩增成功后进行下一步PCR产物纯化试剂盒纯化,纯化后送至英潍捷基上海贸易有限公司进行测序。

将测序结果在GenBank中比对初步确定种并获得各已知霉菌的标准序列,选取同源性较高的相关菌株作为参比对象。

1.3数据处理

多序列比对用MEGA5.05软件进行,并用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树[16]。

2 结果与分析

2.1致霉作用验证结果

将从仓储霉变薏米中分离菌落形态差别比较明显,疑似致霉的15株霉菌菌株,混合反接种到灭菌新鲜薏米中。随着培养时间的延长,薏米的色泽、形态及气味逐渐变化。培养13 d后出现外观形态变化,色泽逐渐变暗变黄,薏米中心不规则凹槽处出现霉点。培养30 d后,色泽暗淡且偏黄,凹槽处霉点肉眼可见,有明显霉味,霉变率为67%。接种薏米与仓储霉变薏米的霉变类型一致。

从接种霉变的薏米中分离纯化霉菌菌株,将分离出的霉菌菌株与所接种菌株的菌落形态及菌丝形态进行比较,8株分离菌株与接种菌株一致,确定为薏米的主要致霉菌株。

2.2霉菌形态学鉴定结果

共筛选出8株致霉菌目标菌落,编号分别为C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7和C8。菌株C1～C8在PDA培养基上的菌落形态及显微形态见图1。主要致霉菌C1～C8的形态学鉴定结果如表2。

图1 霉菌菌落形态(a)与显微形态结构(b,400×)Fig.1 Colony morphology(a)and microscopic structure(b,400×)of mould

表2 霉菌的菌落形态及显微观察Table 2 The colonial morphology and microscopic morphology of the mould

表3 测序比对结果Table 3 The results of sequenceing

根据菌落以及镜检形态,拟初步鉴定菌株C1、C2、C3、C4和C5为曲霉属,C6和C7为镰刀菌属,C8为青霉菌属。

2.3分子生物学鉴定结果

分离菌株ITS基因PCR扩增结果见图2,目标条带为600 bp左右,条带单一且明亮清晰。

将菌株的PCR产物测序后,GenBank中比对初步确定种并获得各已知霉菌的标准序列,选取同源性较高霉菌的标准序列为参比对象,测序比对结果见表3。

图3 以ITS-rDNA基因序列为分子标记的霉菌菌株系统进化树Fig.3 The phylogenetic tree of mould based on ITS -rDNA sequence

图2 分离菌株PCR扩增结果Fig.2 The PCR amplification results of the isolated strains注:M:DNA分子质量标准;阴性:空白对照;1～8:菌株C1～C8基因片段扩增图谱。

选取同源性最高的相关菌株,进行同源性分析,通过构建系统发育树确定菌株的分类地位,将测序数据在GenBank数据库中进行同源序列搜索(BLAST search),系统发育树如图3。

根据分子分类鉴定原则,对ITS区域核苷酸序列进行相似性比对,大于99%的菌株为同种;在99%和95%之间的为相同属;序列相似性小于95%的鉴定为相同科。8株致霉菌株的ITS序列与Genbank中的核酸序列比对相似度均达到99%以上。根据系统发育树分析结果(图3),并结合形态学特征(图1),同源性比对结果表明,C1～C5均为曲霉属(Aspergillussp.),该属置信度聚在一支上,亲缘关系最近,与青霉属亲缘性较近,与镰刀菌属和根霉菌属亲缘性较远,5个菌种之间也存在一定的距离。C1～C5自检支持率均为99%,根据同源性结合形态学分别鉴定为C1米曲霉菌(Aspergillusoryzae)、C2黑曲霉菌(Aspergillusniger)、C3构巢曲霉菌(Aspergillusnidulans)、C4烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus)、C5冠突曲霉菌(Aspergilluscristatus)。C6和C7属于镰刀菌属(Fusariumsp.),分别与Fusariumproliferatum和Fusariumequiseti亲缘关系最近,自检支持率为99%,与该属的另两个镰刀菌自检支持率为95%,亲缘性存在一定的距离,与其他的属之间距离更远。根据形态学特征,确定C6为层生镰刀霉菌(Fusariumproliferatum)和C7为木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)。C8属于青霉属(Penicilliumsp.),与青霉(Penicilliumaethiopicum)同源性最高,自检支持率高达99%,同时依据形态学观察确定C8为青霉(Penicilliumaethiopicum)。C8与C4虽然处于同一分枝,同源性仅为28%,存在一定距离,不属于同一个属。根据系统发育树分析结果分析,自检支持率结果与NCBI比对结果相符。

在对薏米的污染霉菌分析研究中发现,多次分离得到的优势菌株序列比对相同,污染的霉菌有米曲霉、镰刀曲霉、黑曲霉、青霉等,这与Weidenbörner等[17]及Al-Defiery[18]对小麦样品中霉菌污染的报道大致相同,即小麦粉样品中污染的霉菌,以镰孢霉菌和曲霉菌为主。曲霉菌、镰刀霉菌为薏米主要致霉菌菌属,特别是米曲霉在薏米中污染情况普遍,分离频率最高。米曲霉属于黄曲霉群,在一定环境条件下产生黄曲霉毒素,对人类健康存在潜在安全隐患。

3 结论

从已霉变薏米中分离纯化得到15株疑似致霉菌株,通过反接种致霉性验证,发现8株霉菌具有致霉性。接种薏米与仓储霉变薏米的霉变类型一致,接种后霉变薏米再分离菌株与仓储霉变分离到的菌株形态一致。根据传统形态学鉴定结合分子生物方法学鉴定,进化树同源性比对结果与菌株形态特征基本一致。最终确定8株主要致霉菌株分别为C1米曲霉菌(Aspergillusoryzae),C2黑曲霉菌(Aspergillusniger),C3构巢曲霉菌(Aspergillusnidulans),C4烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus),C5冠突曲霉菌(Aspergilluscristatus),C6层生镰刀霉菌(Fusariumproliferatum),C7木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)和C8青霉菌(Penicilliumaethiopicum)。

通过对贵州薏米中致霉菌菌株的鉴定,确定薏米中的主要致霉菌株类型,为薏米储藏技术的开发研究提供了一定的参考依据,今后可以通过抑制霉菌生长条件等相关方法来抑制薏米储藏霉变,延长薏米的储藏时间,降低薏米储藏过程中微生物污染和对人类健康的危害。

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IsolationandidentificationofmoldyfungusfromcoixseedinGuizhou

SHIQing-nan1,2,ZENHai-ying1,WENAn-yan1,HUANGJin1,QINGLi-kang1,*

(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Food and Drug Testing Center of Qiandongnan,Kaili 556000,China)

The moldy fungus were isolated and purified from coix seed originated in Guizhou province. The point planting method was used to observe the growth traits and colony characteristics of fungus on the PDA medium. On the basis of morphological identification,15 strains were isolated from the mould coix seed by the molecular method ITS sequence amplification. Finally,8 strains were categorized and identified,includingAspergillusoryzae(C1),Aspergillusniger(C2),Aspergillusnidulans(C3),Aspergillusfumigatus(C4),Aspergilluscristatus(C5),Fusariumproliferatum(C6),Fusariumequiseti(C7)andPenicilliumaethiopicum(C8). This result showed that the eight strains had obvious influence on coix seed,and were presumed to be the main type of mold in coix seed,which provided reference coix seed storage and anti-mildew inhibition control in future.

coix seed;molds;separation;purification;identification

2017-02-27

石庆楠(1987-)，女，硕士，研究方向：食品加工与安全，E-mail：nn473@126.com。

*通讯作者:秦礼康(1962-)，男，博士，教授，研究方向：粮油和发酵食品加工与安全，E-mail：likangqin@126.com。

贵州省农业攻关项目(黔科合农G字[2012]4001)；贵州省科技重大专项(黔科合重大专项字[2014]6023)；贵州省科技计划课题项目(黔科合LH字[2014]7673)。

TS201.3

:A

:1002-0306(2017)16-0101-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.020