王 梓，杨欣莹，吕 楠，赵 亮，王 宏，王 蕾△(.天津市医药科学研究所，天津 30000； .天津宏仁堂药业有限公司，天津 300000)

【实验研究】

血府逐瘀胶囊对大鼠急性心肌缺血及心肌线粒体超微结构的影响❋

王 梓1，杨欣莹2，吕 楠1，赵 亮2，王 宏1，王 蕾1△
(1.天津市医药科学研究所，天津 300020； 2.天津宏仁堂药业有限公司，天津 300000)

目的：观察血府逐瘀胶囊对大鼠急性心肌缺血及心肌线粒体超微结构的影响。方法：采用冠状动脉左前降支结扎制备大鼠急性心梗模型，给药5 d，通过死亡率、心电图、心脏超声心动、血浆cTn-T、心肌梗死质量、心肌间质及血管周围胶原I、III型胶原分布，电镜观察心肌线粒体超微结构阐明血府逐瘀胶囊对急性心梗的治疗作用及机制。结果：血府逐瘀各剂量组术后即刻死亡率均较模型组降低， cTn-T、LDH、CK降低明显，高、低剂量组可明显降低ST段并改善心功能。各剂量组心肌胶原表达显著降低，对心肌线粒体结构有明显改善作用。结论：血府逐瘀胶囊对大鼠急性心肌梗死有明确的治疗作用，可降低死亡率，降低血浆cTn-T、LDH、CK，改善心电图ST段，增加射血分数，减小左室内径，降低心肌胶原表达，改善心肌线粒体超微结构。

血府逐瘀胶囊；急性心肌缺血；线粒体超微结构；透射电镜

血府逐瘀胶囊临床用于胸痹心痛突然发作(西医学中的心绞痛急性发作)的治疗。本实验通过大鼠结扎做冠状动脉前降支制备急性心肌缺血模型，观察血府逐瘀胶囊对缺血心肌及心功能的影响，进而观察对缺血心肌线粒体超微结构及心肌胶原含量的影响，探讨血府逐瘀胶囊对心肌缺血的保护作用。

1 材料

1.1 试验药物

血府逐瘀胶囊药粉由天津宏仁堂药业有限公司提供，砖红色粉末，2.5 kg/袋(批号E03023)。复方丹参片由广州白云山制药有限公司生产，红色片状(批号20140807)。

1.2 试验动物

SD雄性大鼠80只，购于北京大学医学部实验动物科学部(许可证号SCXK(京)2012-0001)，体质量(230～250) g，动物饲养(许可证号SYXK(津)2011-0003)于实验环境内，每天供给北京科澳协力饲料有限公司生产的普通鼠全价颗粒饲料(产品许可证号SCXK(京)2014-0010)。

1.3 实验仪器

小动物人工呼吸机(Rodent ventilator DH-150)，多道生物信号分析仪(MA2000)，小动物超声成像系统(富士Visual Sonics Vevo 2100)，多功能酶标仪(Infinite200),HITACHI-7500透射电子显微镜, LEICA ULTRACUT-R超薄切片机。

2 方法

2.1 动物分组方法

将大鼠按体质量随机分成假手术对照组、心梗手术组，将心梗手术组大鼠按体质量随机分为模型对照组、血府逐瘀1.6、0.8、0.4 g药粉·kg-1(分别相当于人用剂量的24、12、6倍)、丹参片对照组(人用剂量12倍)5组各12只。

2.2 给药方法

预防性给药2 d，术前30 min前给药1次，术后给药3 d，灌胃给药每天1次。

2.3 造模方法

大鼠灌胃给药3 d，第3天末次给药30 min后，大鼠用4.5%戊巴比妥钠溶液按1 ml·kg-1注射体积腹腔注射麻醉固定于鼠板上，手术器械消毒后，无菌环境下沿大鼠左腋下和胸骨剑突连线处切开皮肤，小心逐层钝性分离大鼠肌肉，小动物呼吸机连接大鼠口鼻(呼吸比1∶3，潮气量32，频率60)，第四、五肋间开胸，快速撕破心包膜后挤出暴露心脏，3-0型号缝合线永久性结扎左冠状动脉前降支，心脏复位后闭胸挤出空气，3-0缝合线缝合大鼠肌肉皮肤。假手术对照组在相同情况下只穿线不结扎心脏。手术前后测量大鼠四肢Ⅱ导联心电图，若术后心电图ST段抬高或QRS波群有明显变化，则视为手术造模成功[1-3]。

2.4 观察指标

2.4.1 大鼠死亡率 记录各组死亡数(手术失败造成大出血、窒息等不列入统计中)，计算存活百分比。

2.4.2 大鼠心电图 多道生物信号分析仪记录大鼠术前后II导联心电图。

2.4.3 大鼠心脏超声心动图 大鼠戊巴腹腔麻醉后，富士Visual Sonics Vevo 2100系统测量大鼠左室后壁(LVPW)、左心室射血分数(LVEF)、心脏室间隔(IVS)，取3个周期的平均值作为实验数据。

2.4.4 大鼠血生化指标 生化仪测定手术后3 h的大鼠血清乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)的含量，化学发光法测定结扎31 h后的血浆肌钙蛋白T(cTn-T)。

2.4.5 大鼠心梗面积及质量百分数 器材消毒后将心脏取出，并用生理盐水冲洗干净，手术刀将心肌切成3 mm待染色用，所取心肌片浸泡在1% NBT染液中染色，白色为心梗部位，红色为非梗死部位。称量全心湿重并剪下梗死部位称量期湿重，计算梗死百分数。

2.4.6 大鼠心肌纤维化及胶原分析 大鼠左心室心肌经脱蜡-苏木素染核-分色-0.1%天狼星红饱和苦味酸溶液染色-酒精，二甲苯透明-中性树胶封片。封片后，400倍显微镜下观察采集图片，采用mage Pro plus6.3图像分析系统，测量血管周围胶原容积分数(PCVF)与心肌胶原容积分数(ICVF)。计算公式为：PCVF=小动脉管腔周围胶原面积/动脉管腔面积，ICVF=胶原面积/总面积，每一标本采集3个视野取均值数据入组。偏振光显微镜观察胶原着色，着色的胶原呈现明亮状态，着色的 I型胶原纤维呈红或黄，排列紧密，具有强双折光性；III型胶原纤维呈绿色，疏网状细纤维，呈弱双折光性。

2.4.7 心肌线粒体超微结构 将处死的大鼠心脏组织迅速切取缺血位置心室肌，每只3块，黄豆粒大小。放入事先4 ℃低温保存的1%四氧化锇+2.5%戊二醛溶液中固定，乙醇升梯度脱水，环氧丙烷过渡、包埋， 50 nm切片行醋酸铀-柠檬酸铅双染色，日立牌透射电镜观察并采集图像。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 血府逐瘀胶囊对术后大鼠死亡率的影响

表1显示，结扎即刻模型对照组死亡率为41.7%，血府逐瘀各剂量组中1.6 g药粉·kg-1达到100%存活，明显低于模型对照组(P<0.05)。

表1 血府逐瘀胶囊对大鼠心梗手术死亡率的影响

注：与假手术对照组比较：▲P<0.05；与模型对照组比较：★P<0.05

3.2 血府逐瘀胶囊对血浆cTn-T及血清LDH、CK的影响

表2显示，与模型对照组比较血府逐瘀胶囊各剂量组对cTn-T、LDH、CK有明显降低作用。

3.3 血府逐瘀胶囊对心电图、超声心动和心肌梗死质量[4]的影响

表3显示，血府逐瘀胶囊各剂量组较模型对照组比较抬高幅度明显降低，降低IVS、升高LVPW，降低EF，改善心功能(P<0.05，P<0.01，P<0.01)。

3.4 血府逐瘀胶囊对急性心肌梗死后心肌胶原分布及左室心肌I、III型胶原含量影响

表4显示，与假手术组比较，模型对照组大鼠左心室肌间隙有大量胶原纤维堆积，血府逐瘀胶囊各剂量组较模型组胶原纤维堆积情况有所减轻，ICVF、PCVF显著降低(P<0.01)。与模型对照组比较，丹参片组、血府逐瘀胶囊各剂量组心肌I型胶原纤维含量显著降低(P<0.01)，III型胶原纤维含量较模型对照组为轻。

表2 血府逐瘀胶囊对心梗大鼠血浆cTn-T、血清LDH、CK的影响

注：与假手术对照组t检验：▲P<0.05，▲▲P<0.01，与模型对照组方差分析：★P<0.05，★★P<0.01

表3 血府逐瘀胶囊对心梗大鼠心电图ST段及超声心动的影响

注：与假手术对照组t检验：▲▲P<0.01，与模型对照组方差分析：★P<0.05，★★P<0.01

表4 血府逐瘀胶囊对急性心肌梗死后心肌胶原纤维及I、III型胶原含量的影响

注：与假手术对照组t检验：▲▲P<0.01，与模型对照组方差分析：★★P<0.01

3.5 血府逐瘀胶囊对大鼠左室心肌线粒体超微结构的影响

模型对照组大鼠心肌细胞排列不规整，多处心肌细胞间存在大量炎细胞、成纤维细胞及小血管(图1B×2000)。有的心肌细胞结构松散(图1B×10000)，有的心肌细胞内肌丝大部分降解只留残影(图1B×20000)。心肌细胞内肌节长度不均一。有的肌丝断裂，断端呈毛刷状(图1B×10000)。线粒体失去规则排列状态，聚集成堆，许多线粒体变形。线粒体肿胀，部分外膜破裂(图1B×30000)，肿胀的线粒体体积增大，基质电子密度下降。线粒体嵴排列紊乱甚至断裂，可见线状致密变嵴，尚有线粒体基质内出现云絮状结构(图1B×30000)。血府逐瘀胶囊3个剂量组对心肌线粒体结构均有明显改善作用，可见心肌细胞排列恢复规整，间质内有少量炎细胞及成纤维细胞存在(图1C×2000)。心肌肌丝排列整齐，连续无断裂(图1C×5000)，心肌肌节排列整齐。横管系统轻到中度扩张(图1E×20000)。心肌细胞内线粒体与肌丝相间排列整齐(图1C×20000)。心肌线粒体大小、形态正常，线粒体嵴结构清晰，少量嵴稍模糊。线粒体基质电子密度中等(图1C×30000)。

图1 左心室心肌线粒体超微结构图(×2000，×5000，×10000，×20000，×30000)注：A.假手术对照组；B.模型对照组；C.血府逐瘀高剂量组；D.血府逐瘀中剂量组；E.血府逐瘀低剂量组

4 讨论

血府逐瘀汤为中医方剂中的理血剂，具有活血化瘀、行气止痛之功效，是清代名医王清任所创，主治胸中血瘀证，药方始收于《医林改错·上卷》。全方由当归、生地黄等11味中药组成，临床常用于治疗冠心病心绞痛、风湿性心脏病、心肌梗死的治疗，取得了较满意的效果[5-6]。有文献报道，血府逐瘀胶囊具有抗心肌细胞损伤、保护心肌的作用[7-8]。本实验旨在研究血府逐瘀胶囊对大鼠急性心肌缺血的作用机制，阐明其保护心肌的作用机理。

cTn-T为急性心肌缺血早期诊断指标，由于其出现时间早、特异性高、敏感度高等特点，因而成为临床早期判断心梗的重要依据之一。cTn-T具有特异性和敏感性，在心肌坏死时释放入血[9-10]。本课题组对大鼠急性心梗模型进行了摸索并得出结论，cTn-T在31 h最接近达峰时间，具有早期诊断心肌梗死的价值，可作为判断AMI时心肌梗死程度和预后的参考指标[11]。本实验中，血府逐瘀胶囊各剂量组可以显著降低急性心肌缺血大鼠cTn-T水平，从而达到保护心肌的目的。在急性心梗、心室重构中存在心肌纤维化，心肌间质中存在异常胶原增生，目前发现，心肌胶原至少有I、III、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型5种，其中I、III型胶原最多，主要构成间质胶原，以纤维形式存在，I型约占80%，III型约占10%。I型属于成熟型胶原，抗张强度大但回弹性小； III型属于胚胎性胶原，回弹性大但抗张性较差。III型胶原增加可引起心室的顺应性增加，I型胶原可以增加心肌僵硬程度，2种胶原的比例可反映心肌纤维化程度，当二者比例失调时易诱发室性心律失常。胶原是保持心脏结构完整和舒缩期几何形态、传递心肌收缩力、维持心室功能的必要成分，现在证明胶原过度沉淀会使心肌僵硬度增加，而胶原降解过度则使心脏发生破裂的可能性增加[12-13]。人体中胶原正常含量在4%左右，当含量增加至10%左右时，便出现心脏舒张顺应性下降，心室充盈速率降低，含量继续增加至20%以上，多余的胶原会封闭地包围正常的心肌细胞，从而导致心脏收缩发生困难诱发心衰[14]。急性心肌缺血大鼠经血府逐瘀胶囊治疗后，I、III型胶原含量与模型组对照组比较显著减少，且二者比例明显降低，趋近于正常含量水平，表明血府逐瘀胶囊能通过改善心肌胶原含量水平，达到保护心肌细胞的目的。人体细胞中，线粒体是一种存在于大多数真核细胞中的由两层膜包被的细胞器，直径在0.5～10 μm左右，是细胞的发电厂，具有产生能量和自由基等作用。线粒体结构的完整性与否可以最直观地反映心肌缺血的程度。线粒体内膜通透性极低，几乎所有的离子甚至质子都不能通过，基质成分和代谢物必须在载体蛋白或高选择性通道的协助下才能实现跨膜运输[15-16]。正常情况下，线粒体外膜对膜间隙蛋白是不通透的，但当发生心肌缺血等情况及线粒体外模通透性增加时，关键性蛋白被释放到细胞质并转移到核内或与内质网上的受体相互作用，打破了线粒体上各种物质的“稳态”，因而线粒体的完整性对心肌细胞的存活至关重要。血府逐瘀胶囊可以使急性心肌缺血大鼠较模型对照组最大程度地保留心肌线粒体的结构，维持心肌线粒体超微结构及线粒体内膜基本功能，尽可能地保护心肌细胞的完整性。

通过以上实验数据我们证实，血府逐瘀胶囊对缺血心室肌线粒体超微结构及心肌中胶原含量具有明显的改善作用，明示了其对保护心肌缺血损伤的作用机制。

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Effects of Xuefu Zhuyu Capsule on acute Myocardial Ischemia and Ultrastructure of Myocardial Mitochondria in Rats

WANG Zi1, YANG Xin-ying2, LV Nan1, ZHAO Liang2, WANG Hong1, WANG Lei1△
(1.TianjinInstituteofMedicalandPharmaceuticalSciences，Tianjin300020,China; 2.TianjinHongrentangPharmaceuticalCo.,Ltd,Tianjin,Tianjin300020,China)

Objective:To observe the effect of Xuefu Zhuyu capsule on rats‘ acute myocardial ischemia and myocardial mitochondria’s ultra structure. Methods: The acute myocardial infarction model was made by the ligation of left anterior descending coronary artery in rats. Administration of 5d.Mortality, electrocardiogram, cardiac echocardiography, cTn-T, myocardial infarction weight, myocardial interstitial and perivascular collagen type I、 III collagen distribution, myocardial mitochondrial ultrastructural, clarify the Xuefu Zhuyu Capsule on the acute myocardial infarction treatment effect and mechanism. Results：Mortality，cTn-T，LDH，CK, ECG ST reduced. Myocardial collagen expression was significantly reduced, and the structure of myocardial mitochondria was significantly improved. Conclusion：Xuefu Zhuyu capsule has a definite therapeutic effect on the acute myocardial infarction in rats, which can reduce the mortality rate, reduce plasma cTn-T, LDH, CK, improve the ECG ST segment, increase ejection fraction, decreased left ventricular diameter, reducing myocardial collagen expression, improve myocardial mitochondrial ultra structure.

Xuefu Zhuyu capsules; Acute myocardial ischemia; Mitochondrial ultrastructure; Transmission electron microscope

天津市“杀手锏”产品研发项目(14ZXSSSY01330)

王 梓(1987-)，男，天津人，助理研究员，医学学士，从事心脑血管病的药理机制研究。

△通讯作者：王 蕾，副研究员，医学硕士，从事心脑血管病的药理机制研究，Tel：022-27236137，E-mail：zws9905@sina.com。

R542.2

B

1006-3250(2017)08-1067-04

2017-01-14