严子祎

（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）

枸杞多糖对老龄小鼠急性毒性研究

严子祎

（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）

研究枸杞（Lycium barbarum.）多糖对老龄小鼠的急性毒性反应。对老龄模型小鼠采取一日内最大耐受量实验。在试验前禁食（不禁水）12 h，然后进行小鼠急性经口毒理试验，每日采用最大浓度、最大体积、一次性灌胃给药，连续观察7 d，记录小鼠的行为、摄食量、体重、粪便和死亡情况，研究枸杞多糖对老龄小鼠的安全性评价。对老龄模型小鼠以最大剂量、最大体积口服灌胃LBP，小鼠毛色、摄食量、体重和粪便情况均无明显异常。小鼠肝脏、脾脏病理切片及血象结果显示无明显异常。枸杞多糖对老龄小鼠无急性毒性反应。

枸杞多糖；急性毒性；D-半乳糖；安全性

枸杞为茄科Solanaceae枸杞属落叶灌木植物，是我国名贵传统中药材，本属约有80多种[1]，我国有7个种和2个变种[2]，主要盛产于我国西北的一些省区。枸杞子除了是传统中药材外还是一种保健食品[3]。其中，宁夏枸杞（Lycium barbarum.）分布最为广泛，同时是唯一被载入《中国药典》的枸杞物种[4]，其味甘、性平[5]，能滋补肝肾、益精明目，用于腰膝酸痛、虚劳精亏、内热消渴、眩晕耳鸣、血虚萎黄、目昏[6]，《神农本草经》中记载枸杞久服可坚筋骨，用作强壮滋补药[7]。枸杞的主要成分是枸杞多糖、氨基酸、微量元素、维生素、牛磺酸、生物碱、挥发油等[8]。枸杞多糖是由枸杞子经水提取，乙醇沉淀等步骤后获得的蛋白多糖[9]，近代许多研究发现，枸杞多糖具有清除自由基，提高抗氧化酶活性，抑制脂质的过氧化和保护生物膜等作用[10]，有助于提高身体的免疫力并且可以增强癌症的治疗效果[11]，还具有抗脂肪肝、降血脂、抗衰老等作用。枸杞是一味在中药方剂中广泛应用的具有视神经保护作用的中药[12]。因此，将其作为功能因子来开发和研制相关的保健食品具有广阔的发展前景。

随着人民生活水平的日益提高，各种药食同源的中药材的急性毒性以及有无致畸致癌的作用越来越受到人们的关注。急性毒性实验是指动物一日内单次或多次给药后，连续观察动物所产生的毒性反应以及死亡的情况[13]。急性毒性实验（单次给药毒性实验）是检测新药对人体毒性强弱的一种手段，并且可以为生殖毒性实验、长期毒性实验、致突变实验等设计实验提供剂量选择依据和相关信息，所以，急性毒性实验对新药的研发和应用是非常有必要的研究[14]。

1 材料与仪器

1.1 材料

枸杞子（哈药集团世一堂制药厂），清洁级雌性小鼠（长春医科大学实验动物中心），小鼠饲料（江苏协通生物工程有限责任公司，批号：20141113）。

1.2 试剂

D-半乳糖、福尔马林固定液、固态石蜡、苏木精-伊红（H.E）、75%酒精、100%酒精、二甲苯。

1.3 仪器

电磁炉（中山市枫叶电器有限公司生产），超净工作台（长沙净化工程公司），抗凝血细胞分析仪（济南格利特科技有限公司），超声提取器（苏州富怡达超声波有限公司），低温高速离心机（德国Eppendorf公司），中药材打粉机（江阴市宝利机械制造有限公司）。

2 实验内容

2.1 枸杞多糖的制备

枸杞子于60℃恒温箱内干燥24 h后粉碎成粉末。以2 400 Hz超声提取25 min，80℃低温煎煮一个半小时后过滤，加入1 600 mL的水煮沸，再煎煮一个小时，再过滤，加入1 000 mL水煮沸后煎煮半小时，最后将所得滤液合并浓缩至260 mL。向浓缩液加入四倍体积量的95%酒精，静置过夜沉淀，而后用离心机3 000 r离心20 min，弃去上清液，得到沉淀。12 h后离心。沉淀物依次用95%的乙醇、无水乙醇洗涤后，经过真空干燥后得到枸杞多糖。加适量生理盐水充分溶解后，4℃保存备用。

2.2 老龄小鼠模型制备

实验采用20只4 w的实验小鼠，随机分为两组，实验环境为通风良好的房间，12/12 h光/暗周期，温度24±2℃，并有自由饮水、基础日粮。小鼠腹腔注射D-半乳糖50（mg·kg-1）·d-16 w，造模老龄小鼠。

2.3 液态石蜡的配制

准备好固体石蜡，将其至于60℃烘箱中熔解石蜡，做好标记，向石蜡中倒入二甲苯如此反复几次。趁石蜡液态时将石蜡凝聚成固态，内含待切组织，保存备用。

2.4 小鼠急性毒性实验

最大给药量（Maximum administration dosage）实验[15]。在前期进行的预试验的结果表明无法测出小鼠口服LBP的LD50，因此，在预实验的基础上选择最大给药量法进行急性毒性实验。实验动物为昆明小鼠，取20只实验鼠，在试验前12 h对试验鼠禁食（不禁水），然后对小鼠进行急性经口毒理试验，采取最大浓度、最大量体积、一次性灌胃给药的方法，每日给药一次，试验时间为7 d，试验期间连续给药。观察和记录小鼠出现的毒性反应和副作用[16]。试验7 d后，将未死亡的小鼠处死并进行尸检。

2.5 试验小鼠肝脏、肾脏病理切片观察

在停药7 d后将存活的小鼠采用断颈处死的方法进行处死。在无菌操作台上，迅速取出小鼠的肝脏和一侧肾脏，将取出的肝脏和肾脏样本放置于中性缓冲福尔马林固定液中进行固定，石蜡包埋，切片机切片。采取常规苏木精-伊红（H.E）染色法染色，在光学显微镜下进行相应的病理学观察。

2.6 试验小鼠的血液生理指标变化

在停药7 d后，采用眼球取血的方法对试验小鼠取血，血液经过抗凝处理后，利用血细胞分析仪，检测小鼠的红细胞数（Rbc）、白细胞数（Wbc）和血红蛋白（Hb）含量。

2.7 统计学处理

利用Origin7.5分析软件进行统计分析，两组间差异检验采用t检验，多组资料采用单因素方差分析（One-way ANOVA）[17]。

3 结果与分析

3.1 急性毒性实验结果

对老龄模型小鼠进行最大浓度、最大体积连续灌胃给药7 d处理，然后对老龄模型小鼠生理活动和行为进行观察：小鼠毛色光滑、粪便色泽和质地与正常小鼠相比无明显差异，小鼠均正常活动，且在灌胃处理的一周内无死亡以及其他异常的现象出现。对老龄小鼠断颈处死并尸检，对各器官进行肉眼观察，经初步直接观察发现各主要脏器（如心、肺、脾、肝、肾）均无明显异常的变化。

3.2 肝脏和肾脏的病理切片观察

在光学显微镜下，急性毒性试验的小鼠肝小叶结构较完整，肝细胞排列整齐，细胞核清晰，胞浆丰富，中央静脉居中，肝索向四周呈放射状分布，肝脏切片观察结果正常（图1 A）。急性毒性小鼠肾脏病理切片显示，肾小球、肾小管结构清晰可见，肾细胞排列紧密，肾小球形状规则，肾小管结构明显、清楚（图1B），与正常的小鼠肾脏切片相比无明显差异。肝脏和肾脏的切片观察结果表明枸杞多糖对小鼠肝脏和肾脏组织没有形成明显的毒性反应。

图1 A肝脏病理（HE×200）Fig.1 AThe pathology of liver（HE×200）

B肾脏病理（HE×200）BThe pathology of kidney（HE×200）

表1 急性毒性试验前、后小鼠血象变化（±S.D.n=10）Table 1The mouse blood changes before and after acute toxicity test

表1 急性毒性试验前、后小鼠血象变化（±S.D.n=10）Table 1The mouse blood changes before and after acute toxicity test

Control groupStudy group Testing item Rbc（×1012·L-1）Wbc（×109·L-1）Hb（g·L-1）Pre-test 5.22±0.57 9.64±0.36 144.66±9.12 Post-test 5.39±0.52 9.83±0.31 146.37±8.74 Pre-test 5.77±0.54 9.95±0.42 148.89±9.53 Post-test 5.65±0.57 9.84±0.38 148.89±9.53

3.3 试验前、后小鼠血液生化指标的变化

在进行小鼠急性毒性试验前和试验结束一周后，对小鼠的相关血液生化指标进行测定，结果如表1所示。对试验得到的数据进行统计检验，统计结果表明：在急性毒性试验前、后，小鼠血液中的红细胞数（Rbc）、白细胞数（Wbc）和血红蛋白（Hb）含量变化均不大，差异不显著（P＜0.05），各生理指标也均在正常生理范围内。结果表明枸杞多糖对小鼠的机体健康无明显损伤。

4 结论与讨论

综上所述，根据对小鼠的生理表征及病理切片观察可知，枸杞多糖对老龄模型小鼠无毒性，为其临床研究提供了更加充分的理论证据。

急性毒性试验（Acute toxicity testing）是指在一日内一次或多次应用药物给予动物，短期内所产生的毒性反应及动物的死亡情况，为新药临床前毒理学研究的第一步[18]，通过枸杞多糖对老龄小鼠急性毒性实验研究发现，最大量给老龄小鼠灌胃并无明显的毒性反应，说明枸杞多糖为无毒性物质。实验说明，对小鼠以最大量灌胃一周时从肉眼观察可见小鼠的毛色、摄食量、粪便等均无明显异常，初步证明枸杞多糖的成分对老龄鼠健康无影响。再深入对小鼠尸检情况分析研究，发现老龄小鼠的心脏、肾、脾、肺等颜色状态并无明显变化异常。对小鼠脏器进行病理切片进行观察，发现老龄小鼠的肝小叶结构完整，中央静脉居中，肝索向四周呈放射状分布，胞核清晰。对实验小鼠前后的血象观察发现，小鼠Wbc、Rbc、Hb亦无明显变化，均在正常范围内，说明枸杞多糖对老龄小鼠的血液无毒性反应。经Jing L等[19]研究发现，枸杞多糖且具有显著的降血糖作用。

在试验中发现小鼠对LBP的作用均无显差异，可推知LBP对小鼠的作用无明显差异。且由实验可以发现，灌服LBP的小鼠生理表征良好，且与对照组相比较，衰老程度减慢。Harunobu Amagase等人研究发现，枸杞对小鼠的总体幸福感及耐力的提升具有一定的帮助[20]。

参考文献：

［1］王建华.枸杞多糖的结构与保健功能评价［D］.武汉：华中农业大学，2001.

［2］孙桂菊，左平国.枸杞多糖功效研究及应用状况［J］.东南大学学报：医学版，2010，29（2）：209－215.

［3］甘璐，张声华.枸杞多糖的抗肿瘤活性和对免疫功能的影响［J］.营养学报，2003，25（2）：200－202，214.

［4］孙桂菊，左平国.枸杞多糖功效研究及应用状况［J］.东南大学学报：医学版，2010，29（2）：209－215.

［5］魏永祥，商学礼.枸杞多糖的研究进展［J］.安徽农业科学，2010，38（11）：5834－5836，5840.

［6］陈吉生，吕剑豪.枸杞多糖提取工艺研究［J］.医药导报，2010，29（5）：649－652.

［7］王建华.枸杞多糖的结构与保健功能评价［D］.武汉：华中农业大学，2001.

［8］冯彦.枸杞多糖药理作用与临床应用［J］.中国现代药物应用，2016（6）：278－278，279.

［9］龚涛，王晓辉，赵靓，等.枸杞多糖抗氧化作用的研究［J］.生物技术，2010，20（1）：84－86.

［10］Skaper，stephen D，Facci，et al.Reply to：Palmitoylethanolamide：problems regarding micronization：ultra－micronization and activitives Inflammopharmacology［J］.Inflammopharmacology，2015，23（2/3）：127－130.

［12］Hua Wang，Benson Wui－Man Lau，Ning－li Wang，et al. Lycium barbarum polysaccharides promotes in vivo proliferation of adult rat retinal progenitor cells［J］.中国神经再生研究：英文版，2015，10（12）：1976－1981.

［13］周小涵，廉美兰，杨帆，等.壳聚糖和木聚糖对人参不定根中皂苷积累的影响［J］.延边大学农学学报，2015（3）：217-220.

［14］冯浩丽，高建平.党参多糖体内抗肿瘤活性研究及急性毒性实验［J］.山西中医，2012，28（8）：49－50.

［15］刘艳.五味子甲素对小鼠的急性毒性实验［J］.中外健康文摘，2013（19）：99－100.

［16］黄福荣.新毒康胶囊急性毒性实验［J］.科技风，2014（23）：57－57.

［17］赵蕊，蔡亚平，陈志宝，等.马齿苋多糖对老龄荷瘤小鼠抗宫颈癌的作用［J］.中国老年学杂志，2013（18）：4480-4482.

［18］刘艳.五味子甲素对小鼠的急性毒性实验［J］.中外健康文摘，2013（19）：99－100.

［19］Jing L，Cui G.Evaluation of hypoglycemic activity of the polysaccharides extracted from Lyciun barbarum Afr J Tradit Complement Altern Med.2009（4）：579－84.

［20］Harunobu Amagase，NormanR，Farnsworth.A review of botanical characteristics，phytochemistry，clinical relevance in efficacy and safecy and safety of Lycium barbarum fruit［J］.FoodResearcIntational，2011，44（7）：1792－1717.

Acute Toxicity Experimental Study of Barbarum Polysaccharide on Aged Mice

Yan Ziyi
（College of life Science，Northeast Agricultural University，Haerbin 150030）

One day maximum tolerance test was adopted to study the acute toxicity of Lycium barbarum polysaccharide on aged mice.12 hours of fasting（except water）before the test，then acute oral toxicity test was conducted using daily maximum concentration and volume，disposable intragastric administration，observed for 7 days，behavior，food intake，weight，stool and mortality of the mice were recorded to study the safety evaluation ofLycium barbarumpolysaccharide on aged mice.The coat color，food intake，weight and stool were not abnormal significantly after the aged mice were given by gavage LBP with maximum dose and volume.And the liver，spleen pathological section and blood had no obvious abnormalities either.It could conclude that there was no toxic effects ofLycium barbarumpolysaccharide on aged mice.

Lycium barbarumpolysaccharide；acute toxicity；D-galactose；safety

R285.5

A

1002-2090（2017）04-0078-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.017

2016-12-20

严子祎（1996-），女，东北农业大学生命科学学院制药工程专业2014级学生。