徐亚娟 金志巍 刘莉莉 刘文书

(吉林省肿瘤医院口腔颌面肿瘤外科，吉林 长春 130012)

人参皂苷Rh2诱导口腔鳞癌耐药细胞凋亡

徐亚娟 金志巍 刘莉莉 刘文书1

(吉林省肿瘤医院口腔颌面肿瘤外科，吉林 长春 130012)

目的探讨人参皂苷Rh2对口腔鳞癌耐药细胞(KBV)的促凋亡作用及其对时间和剂量的时效量效关系。方法采用MTT法检测人参皂苷Rh2于不同时间和浓度下对KBV的生长抑制作用及药物毒性实验；通过台盼蓝染色进一步检测Rh2不同浓度和时间下诱导KBV的死亡率；利用提取Rh2作用后DNA进行琼脂糖凝胶电泳观察KBV细胞基因组降解情况。结果48 h内，KBV细胞在0～100 μg/ml的Rh2诱导下，其所导致的生长抑制率随着时量和剂量的增加而有所加强，对正常细胞的抑制率均在10%以下并且台盼蓝染色得到的死亡率不超过12%，细胞DNA在人参皂苷Rh2作用后发生降解，琼脂糖电泳呈梯形条带。结论人参皂苷Rh2是一种安全有效毒副作用小的药物，其对KBV的抑制作用主要由凋亡引起，并随着浓度和时间的不断增加，持续作用于耐药癌细胞。

口腔鳞癌细胞;耐药性;凋亡;Rh2

口腔鳞癌在口腔颌面部的恶性肿瘤中占较高比重，常用的临床治疗手段包括手术、化学、放射和靶向治疗等，其中化学治疗是术后最常用的辅助治疗手段，但现有临床药物大多毒副作用较高，且长期使用过程中，细胞耐药性使化疗效果大大减弱〔1〕。这种现象是由于P-糖蛋白、耐药性相关蛋白及凋亡抑制基因等表达所引起〔2〕。据美国癌症协会调查，不同程度的耐药会导致90%以上的癌症患者死亡〔3〕。人参皂苷Rh2在肿瘤治疗方面安全有效，不仅具有促凋亡、抑生长、防转移等能力〔4〕；可杀伤胆囊癌、肠癌、胰腺癌等多种肿瘤细胞〔5～7〕；且对于乳腺癌、肺癌及肝癌等因化学药物产生的耐药性发生逆转作用〔8～12〕，能够通过诱导凋亡作用于P-糖蛋白介导的耐药现象〔13〕。但目前人参皂苷Rh2单体对口腔鳞癌耐药细胞(KBV)的凋亡作用及其对剂量和浓度的时效量效关系尚未见有关报道。本实验主要采用经顺铂诱导KBV经Rh2作用后，分别通过检测药物于不同时间与浓度的生长抑制率和细胞死亡率，同时鉴定细胞DNA片段，为人参皂苷Rh2诱导肿瘤细胞凋亡研究提供重要数据。

1 材料与方法

1.1材料 人永生化上皮细胞(HaCaT)和人口腔鳞癌细胞(KB)由吉林省肿瘤医院供应。人参单体Rh2由长春理工大学生命学院提供。细胞基因组DNA提取试剂盒为天根生化科技有限公司产品。曲利苯兰(台盼蓝)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)由北京鼎国昌盛有限责任公司提供。RPMI-1640细胞培养干粉购自美国Sigma公司。

1.2方法

1.2.1KBV制备 通过梯度浓度(1、2、3、4、5、6 μg/ml)的顺铂诱导KB，用正常和加药的完全RPMI-1640于37℃、5%CO2条件下间隔培养至耐药6 μg/ml。6个月后，将口腔鳞癌及耐药细胞按每孔6×103个接种于96孔细胞培养板，150 μl/孔细胞悬液贴壁后，加100 μl的1～6 μg/ml浓度梯度顺铂，设3个副孔。培养48 h后弃上清，加20 μl MTT在避光条件下于培养箱中4 h后，加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)低速摇床10 min，酶标仪波长设置为490 nm检测OD值计算细胞活性。

1.2.2MTT法检测细胞生长抑制率 取对数生长期的KBV和人永生化上皮细胞HaCaT，用胰蛋白酶消化后，用完全培养液调成浓度为6×103/ml的单细胞悬液，上述方法铺板，每孔中添加100 μl含梯度浓度Rh2单体和5-氟尿嘧啶(0、20、40、60、80、100 μg/ml)的完全培养液，每个浓度设3个复孔培养12、24、48 h。重复上述MTT测定过程检测细胞活性计算不同时间与浓度下的生长抑制率。

1.2.3台盼蓝染色鉴定细胞死亡情况 分别取加药后12、24和48 h的KBV，胰酶消化重悬后按照9∶1的比例与0.4%的台盼蓝染液均匀混合，在室温下染色3 min后置于显微镜下观察细胞染色情况，计算5-氟尿嘧啶和Rh2诱导细胞死亡率。

1.2.4琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段 取对数生长期的KBV，加入不同质量浓度的Rh2(20、40、60、80、100 μg/ml)，12 h后通过提取上药细胞基因组在制取浓度为1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳来观察DNA片段断裂情况。

2 结 果

2.1KBV鉴定 在顺铂浓度较低时对细胞活性影响不显著，而当浓度>2 μg/ml时，正常癌细胞死亡率增高对顺铂无耐受性，而耐药细胞活性略有降低但仍高于KB细胞，KBV对于顺铂的耐受性明显高于KB细胞。见图1。

图1 梯度浓度顺铂对KB及KBV细胞活性的影响

2.2人参皂苷Rh2对KBV细胞的抑制率测定 设5-氟尿嘧啶为阳性、完全培养基为空白对照，Rh2与5-氟尿嘧啶对KBV均有抑制作用，同时其效果随着浓度与时间的加强而逐渐增强。其中5-氟尿嘧啶在24 h内作用速度快杀伤力强，24～48 h作用减弱，效果弱于初期，而人参皂苷Rh2在48 h内对KBV作用速度增加稳定，缓慢作用持续上升。见图2。

图2 不同浓度和时间下Rh2、5-氟尿嘧啶对KBV细胞的生长抑制作用

2.3人参皂苷Rh2对正常细胞毒性检测 Rh2作用于HaCaT细胞的48 h内，细胞的生长抑制率虽有所增加，但均不超过10%，且不随着浓度升高而增加，而相同时间内5-氟尿嘧啶对细胞生长抑制率不断增长，均大于41%，远高于Rh2对细胞的生长抑制作用。见图3。

图3 不同浓度和时间下药物对HaCaT细胞的生长抑制作用

2.4琼脂糖电泳检测细胞凋亡 图4结果显示，12 h时细胞DNA已开始降解，在20和40 μg/ml降解现象不明显，随着药物的浓度的上升，在60～100 μg/ml的Rh2作用下，细胞基因组DNA片段化逐渐明显，可观察到明显梯形条带，证实细胞凋亡现象产生。

2.5细胞死亡率检测 5-氟尿嘧啶在48 h内所引起的细胞死亡率要远高于Rh2，且随着浓度和时间正向延伸，5-氟尿嘧啶的死亡率明显升高，而人参皂苷Rh2较为平缓，由于台盼蓝凋亡小体拒染现象，结合MTT法测定的抑制率证实在药物对于细胞的抑制过程中，Rh2导致细胞死亡的主要作用在于诱导凋亡，而5-氟尿嘧啶则主要是坏死作用。见表1。

表1 Rh2和5-氟尿嘧啶作用于不同浓度与时间的细胞坏死率

A：100 μg/ml B：80 μg/ml C：60 μg/ml D：40 μg/ml E：20 μg/ml F：0 μg/ml G：Marker图4 不同浓度Rh2对细胞DNA的降解作用

3 讨 论

口腔鳞癌目前仍是威胁人们生命的重大疾病，由于手术极易损伤面部，化疗成为治疗口腔鳞癌最重要的手段，虽然目前常用的临床治疗药物顺铂、5-氟尿嘧啶及紫杉醇等虽有较好的治疗效果，但毒副作用高和致免疫力低下等可引起许多其他疾病的发生〔13〕，除此外还极易产生耐药性〔14〕。KBV细胞是以对顺铂较为敏感的KB细胞通过顺铂浓度梯度刺激后诱导而成，其耐药程度远高于KB细胞，可作为研究肿瘤细胞耐药性的良好材料。郗照勇等〔15〕对在研究顺铂耐药的分子机制的过程中发现，顺铂的耐药主要是通过抑制凋亡信号传导和DNA修复损伤、减少药物累积和增强去活作用等。本实验结果表明，KBV对顺铂耐受良好，而Rh2在作用于KBV细胞的48 h内，其导致的生长抑制率在实验范围内随着时间与剂量的增加而增加，并且持续作用于KBV的同时，对人体正常细胞伤害极小，证实Rh2是一种安全低毒且在体外对KBV有良好抑制作用的药物。

细胞凋亡是在基因控制下自主死亡并可稳定内环境的有序过程，不发生炎症反应，过程中细胞膜保持完整，并在核酸酶作用下发生DNA降解，因此会发生台盼蓝拒染现象和产生200 bp左右整倍数核苷酸片段。本研究中，结合MTT法与台盼蓝染色，发现MTT法得到的生长抑制率要远高于台盼蓝染色得到的死亡率，证实Rh2导致KBV细胞的主要死亡方式在于凋亡，并通过提取药物作用于KBV细胞的基因组进行DNA电泳所形成的特异性梯状条带，发现KBV从12 h开始出现凋亡，并且随着药物浓度的上升，DNA降解越完全。

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〔2017-02-20修回〕

(编辑 袁左鸣)

刘文书(1966-)，男，博士，教授，硕士生导师，主要从事口腔颌面外科研究。

徐亚娟(1965-)，女，主任医师，主要从事口腔颌面肿瘤研究。

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A

1005-9202(2017)16-3956-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.021

1 吉林大学第一临床医院口腔科