吴忠练 黄学宽 骆 言 张超男 蒋 娟 万 磊 王 玲

(重庆医科大学中医药学院，重庆 401331)

贝母瓜蒌散对慢性阻塞性肺疾病大鼠p38MAPK和MIP-T3表达的影响

吴忠练 黄学宽 骆 言1张超男 蒋 娟 万 磊 王 玲

(重庆医科大学中医药学院，重庆 401331)

目的观察贝母瓜蒌散对慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠肺组织中p38MAPK信号通路和肿瘤相关因子受体因子MIP-T3的影响。方法将40只SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、地塞米松组及贝母瓜蒌散组，每组10只；采用脂多糖(LPS)气管滴入加烟熏法制造COPD大鼠模型，为期30 d。从造模第8天开始，地塞米松组给予地塞米松注射液腹腔注射(2 mg/kg)，贝母瓜蒌散组给予贝母瓜蒌散灌胃(20 ml/kg)，1次/d，连续22 d，模型组予0.9% 生理盐水灌胃(20 ml/kg)。Western印迹检测p38MAPK蛋白和MIP-T3蛋白的表达水平。结果与正常组比较，模型组大鼠肺组织p38MAPK和MIP-T3的表达明显升高(P<0.05)；与模型组比较，地塞米松组和贝母瓜蒌散组可降低大鼠肺组织中p38MAPK和MIP-T3的表达(P<0.05)；而地塞米松组和贝母瓜萎散组p38MAPK和MIP-T3的表达无明显差异(P>0.05)。结论贝母瓜蒌散有抑制p38MAPK和MIP-T3表达的作用。

贝母瓜蒌散；慢性阻塞性肺疾病；p38MAPK；MIP-T3

气道炎症反应在慢性阻塞性肺病(COPD)发病过程中起重要作用，COPD较普通人群更容易发生肺癌〔1〕。贝母瓜蒌散可润肺清热，理气化痰，尤其方中川贝在我国有广泛的运用〔2〕，在我国咳嗽患者服用川贝蒸梨缓解咳嗽症状疗效甚佳。瓜蒌可以宽胸理气，现代研究证明改善心功能和血液流变学指标〔3〕。贝母瓜蒌散出自《医学心悟》卷3：“燥痰涩而难出，多生于肺，肺燥则润之，贝母瓜蒌散。”冉先德《历代名医良方注释》“燥痰之证，多由肺阴不足、虚火灼津而成。”研究证明p38MAPK信号通路是炎症相关的信号通路〔4〕，脂多糖(LPS)气管滴入可刺激大鼠肺泡巨噬细胞释放的炎性细胞因子，肿瘤坏死因子(TNF)和p38MAPK的表达明显上升，说明p38MAPK信号通路的激活对炎性细胞因子和TNF等释放有促进作用。而加入p38MAPK特异性抑制剂，则可抑制MAPK信号通路的转导和表达，而减少炎症介质等释放，减缓COPD发展进程。本实验观察贝母瓜蒌散对COPD大鼠肺组织中p38丝裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)和肿瘤坏死因子受体相关因子3结合蛋白(MIP-T3)1的表达，作为研究贝母瓜蒌散对COPD大鼠的作用机制。

1 材料和方法

1.1主要试剂与仪器 贝母瓜蒌散(川贝母、瓜蒌、天花粉、茯苓、橘红、桔梗)，冷水浸30 min，煮沸后煎30 min，共煎3次，合并药液，浓缩为含2.0 g生药/ml，购于西部大药房，由中医药学院鉴定；地塞米松注射液(山东新华制药股份有限公司)，SDZ-Ⅱ型电针仪(苏州医疗用品有限公司)，LPS(美国Sigma公司)，宏声牌香烟(川渝中烟工业有限责任公司，焦油量11 mg/支，烟气CO量12 mg/支，烟气烟碱量10 mg/支)，MIP-T3抗体(Santa Cruz)，p38MAPK(EPITOMICS)。高速离心机(美国Sigma)，凝胶成像分析系统(GDS8000，英国UVP公司)，光学显微镜BH-2型(日本Olympus)，显微摄像仪(Olympus)；多功能真彩色细胞图像分析管理系统Image-Pro Plus(美国Media Cybernetics公司)等。

1.2动物分组与造模 清洁级雄性SD大鼠，40只，体重(200±20)g，由重庆医科大学实验动物中心提供〔生产许可证号：SCXK(渝)2007-0001〕。将大鼠随机分为正常组、模型组、地塞米松组和贝母瓜蒌散组，每组10只，适应性饲养1 w后，除正常组外，参照宋一平等〔5〕的方法，将其余30只大鼠分别于第1、15天气道内注入LPS生理盐水溶液(200 μg/100 μl)；第2～14天、16～30天则将大鼠置于密闭玻璃染毒箱中，香烟插在50 ml注射器针头上，点燃并抽推活塞，将产生的烟雾注入箱内，浓度达5%左右(每次约打入3 600 ml烟雾)，使大鼠被动吸烟，持续30 min后再将大鼠移出染毒箱，2次/d，每次间隔4 h以上，其余时间正常喂养。造模过程注意观察大鼠的一般情况。实验过程中对动物处置符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.3治疗方法 实验造模第8天起，正常组：不造模，每日予以0.9%生理盐水20 ml/kg连续灌胃，1次/d，连续22 d。模型组：造模，每日予以0.9% 生理盐水20 ml/kg灌胃，每日1次，连续22 d。地塞米松组：造模，用地塞米松注射液腹腔注射(2 mg/kg)，1次/d，连续22 d。贝母瓜蒌散组：造模，用贝母瓜蒌散20 ml/kg灌胃，每日1次，连续22 d。

1.4肺组织病理观察及p38MAPK、MIP-T3表达的测定 解剖取出大鼠的肺，用生理盐水洗净肺组织表面残血，滤纸吸干后，精密称取0.1 g肺组织研磨，滴加蛋白裂解液0.5 ml使之裂解。低温4℃离心10 min(3 000 r/min)，取上清液。在上样缓冲液中加入100 μg蛋白煮沸3分，12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。转聚偏氟乙烯(PVDF)膜，37℃ TTBS封闭液封闭2 h，滴加兔抗鼠p38MAPK、MIP-T3单克隆抗体，4℃冰箱内过夜，加1∶2 500辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗，37℃放置2 h，用二氨基联苯胺(DAB)显色。抗体剥脱液剥脱抗体后，相同方法与1∶300的β-actin抗体孵育。内参以β-actin 蛋白条带为准，分析灰度值，计算目的蛋白相对表达量。

1.5统计学方法 采用SPSS18.0统计软件进行单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。

2 结 果

2.1大鼠一般状态及肺组织病理学改变 与正常组比较，模型组大鼠明显出现了咳嗽、喘、精神不振、张口抬头、口角流涎等。经过贝母瓜蒌散和地塞米松干预的大鼠上述症状和体征明显减轻或消失。实验结束后，正常大鼠肺组织颜色偏白，而模型组大鼠肺组织灰白晦暗呈膨隆状，地塞米松组和贝母瓜蒌散组大鼠肺组织颜色灰暗明显较模型组好转。

2.2大鼠肺组织p38MAPK和MIP-T3蛋白的表达 与正常组比较，模型组肺组织p38MAPK和MIP-T3的表达水平升高(P<0.05)；与模型组比较，地塞米松组和贝母瓜蒌散组p38MAPK和MIP-T3的表达明显下降(P<0.05)；而地塞米松组和贝母瓜组相比，两者无显著性差异(P>0.05)。见表1，图1。

表1 大鼠肺组织中p38MAPK和MIP-T3表达灰度值(±s)

与正常组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05

1正常组；2模型组；3地塞米松组；4贝母瓜蒌散组图1 各组肺组织p38MAPK和MIP-T3的表达

3 讨 论

COPD是以进行性气流受限为特征的慢性疾病，与香烟烟雾等有害气体或粉尘颗粒等引起的肺部异常炎症反应相关，主要病理改变是慢性炎症所致的气道损伤、修复、重塑等，与COPD的发病密切相关。本实验通过气管滴注LPS和被动吸烟法制备COPD大鼠模型。

炎症反应中p38MAPK信号转导通路占很重要地位，它参与细胞存活、分化和发育等过程，实验表明p38MAPK能增强细胞存活概率，也能抗凋亡。特别在炎症反应时抗凋亡能力更强〔6〕。研究显示，p38MAPK可能参与支气管哮喘的发病过程〔7〕。另外，肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)是TNF超家族成员之一，不仅能加强TNFR诱导的炎症因子的产生〔8〕，还与炎症细胞的分化有关，介导机体自然免疫和获得性免疫〔9〕。MIP-T3，可能参与胞质中合成的纤毛蛋白运送到纤毛内组装的过程。在MIP-T3突变、缺陷和敲除后纤毛会出现不同程度的改变，如纤毛稀疏、短小、微管结构缺陷或紊乱。人体观察发现MIP-T3在人体很多组织中，比如在支气管、肺组织都有表达。COPD患者存在气道上皮纤毛结构和功能的异常，纤毛的异常会导致黏液纤毛清除功能的障碍，引起分泌物异常分泌，小气道受阻，局部防御系统破坏，引起反复炎症反应及感染，是疾病反复发生并渐渐加重的关键原因之一〔10〕。纤毛的结构和功能异常在COPD的发病中起重要作用。另外，TRAF肿瘤坏死因子受体相关因子在肺癌患者肺组织中表达明显升高〔11〕。

本文结果显示贝母瓜蒌散可以抑制p38MAPK信号通路，抑制COPD大鼠肺组织的炎症反应。对MIP-T3的抑制可能反映了贝母瓜蒌散能通过抑制COPD的炎性反应从而抑制了COPD恶性病变的趋势。

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4黄翠萍,张珍祥,徐永健,等.p38蛋白激酶对大鼠肺泡巨噬细胞活化机制的调控〔J〕.中国病理生理杂志,2003;19(5):661-3.

5宋一平,崔德健,茅培英,等.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立及药物干预〔J〕.中华内科杂志,2000;39(8):556-7.

6梁先敏,杨克敌.Caspase和JNKPSAPK、p38MAPK与细胞凋亡〔J〕.国外医学·卫生学分册,2008;35(1):5-10.

7黄翠萍,杨和平,杨颖乔,等.黄芪注射液对哮喘大鼠p38MAPK和Th1/Th2类细胞因子变化的影响〔J〕.中国病理生理杂志,2008;24(12):2386-90.

8Wicovsky A,Henkler F,Salzmann S,etal.Tumor necrosis factor receptor-associated factor-1 enhances proinflammatory TNF receptor-2 signaling and modifies TNFR1-TNFR2 cooperation〔J〕.Oncogene,2009;28(15):1769-81.

9Dupoux A,Cartier J,Cathelin S,etal.clAP1-dependent TRAF2 degradation,regulates the differentiation of monocytes into macrophages and their response to CD40 ligand〔J〕.Blood,2009;113(1):175-85.

10高志睿.MIP-T3在慢性阻塞性肺疾病患者呼吸道上皮的表达研究〔D〕.广州:南方医科大学,2011.

11黄建安,王天立,王光杰,等.CD40配基化对肺癌细胞肿瘤坏死因子受体及相关因子表达的影响〔J〕.江苏医药杂志,2004;30(9):641-3.

〔2016-05-13修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

重庆市渝中区科技项目(No.20110318)

黄学宽(1972-)，男，教授，硕士生导师，主要从事中医基础理论与临床研究。

吴忠练(1960-)，男，讲师，主要从事中医经典及临床运用研究。

R289.5

A

1005-9202(2017)16-3936-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.012

1 重庆市中医院