蔡克瑞 刘志新 孙晓冬 梁 军 闫 磊

(牡丹江医学院组胚教研室，黑龙江 牡丹江 157011)

缓激肽对体外培养大鼠血视网膜屏障通透性的影响

蔡克瑞 刘志新 孙晓冬 梁 军 闫 磊

(牡丹江医学院组胚教研室，黑龙江 牡丹江 157011)

目的探讨缓激肽对体外培养大鼠血视网膜屏障通透性的影响。方法将缓激肽作用于Transwell小室建立体外培养的大鼠视网膜血管内皮细胞(REVC)间紧密连接屏障模型，通过跨上皮细胞电阻(TER)值观察缓激肽对大鼠REVC间紧密连接结构的影响；RT-PCR 法检测紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin mRNA表达水平的变化。结果实验组作用2 h的TER值小于测量前、作用4 h组和对照组(P<0.01)；实验组作用4 h组和测量前、对照组TER值无明显变化(P>0.05)。结论缓激肽可在转录水平上减少紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin mRNA表达，能够开放大鼠REVC间的紧密连接，增加血视网膜屏障的通透性。

缓激肽；视网膜血管内皮细胞；紧密链接

血视网膜屏障是机体维持眼内环境稳定的重要结构之一，可以选择性滤过血液中的有用物质。这种功能在维持眼内环境稳定的同时，也限制药物向眼内组织传递，从而严重影响疗效。血视网膜屏障也是药物治疗糖尿病所致视网膜病变、视网膜动静脉阻塞等眼底疾病的主要制约因素。视网膜血管内皮细胞(REVC)在各种眼底病发病中都起着关键作用，本研究利用Transwell小室建立体外培养的大鼠REVC间紧密连接屏障模型，观察缓激肽对大鼠血视网膜屏障通透性的影响。

1 材料与方法

1.1材料 SPF 级大鼠30只，质量80～110 g，雌雄不限(牡丹江医学院实验动物中心提供)。DMEM/F12培养基、D-Hank液(美国Hyclone公司)；胎牛血清、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；第Ⅷ因子相关抗原抗体(美国Sigma公司)；24孔板Transwell小室，膜孔径0.4 μm(美国Millipore公司)，Millicell-ERS 电阻测量仪(美国Millipore公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠REVC的获取和细胞培养 取SPF级大鼠1只，过量麻醉处死，无菌下在赤道部剪开眼球，去除眼前节及玻璃体，用眼科剪小心分离视网膜，用2%胰蛋白酶室温消化视网膜30 min,边消化边吹打视网膜,取出残留的视网膜,除去可见的大血管后剪碎、匀浆,滤网过滤(孔径100 μm),用0.1%Ⅱ型胶原酶消化30 min,加入含有体积分数20%的胎牛血清DMEM/F12培养液终止消化，1 000 r/min离心10 min，收集细胞。加入含有体积分数10%的胎牛血清DMEM/F12培养液，滴加重组牛碱性成纤维细胞生长因子，置于5%CO2自动调节保温箱培养(37℃)，每2～3 d换液，不断洗去崩解的视网膜碎片及死亡的其他细胞,待细胞汇合单细胞层后,按1∶2传代。

1.2.2大鼠REVC的鉴定 将盖玻片放入培养瓶内消化细胞，37℃孵育24 h，待细胞爬满后取出，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗2次，用冷丙酮固定10 min，PBS漂洗细胞，加入第Ⅷ 因子相关抗原抗体，另外细胞加入PBS作阴性对照，37℃孵育1 h，用PBS漂洗3次，卵白素-生物素-酶复合物(SABC)法染色，二氨基联苯胺(DAB)/H2O2显色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

1.2.3体外培养的大鼠REVC间紧密连接屏障模型的建立 取培养的大鼠REVC经2.5 g/L胰酶消化后，以5×104个/ml的细胞密度接种于铺有层黏连蛋白的Transwell小室中，上室加入400 μl细胞悬液，下室加入600 μl培养液，接种后第1天及之后每周换液2次，所用培养液为含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液。

1.2.4缓激肽对体外培养的大鼠REVC间紧密连接屏障模型的影响 将在Transwell小室中培养15 d以后的大鼠REVC作为实验对象。实验分为实验组和对照组；加入含缓激肽的DMEM/F12培养液，使缓激肽作用时间分别为2 h和4 h。作用相应时间后，用跨上皮细胞电阻测定仪(EVOM)测定跨上皮细胞电阻(TER)值，单位为Ω×cm2，最终测量值为膜连同大鼠REVC的电阻值减去背景电阻值，每一孔电阻的测量至少重复3次，每一时间点至少用不同的3个孔进行测量。

1.2.5RT-PCR 法检测紧密连接相关蛋白occludin 和ZO-1 mRNA的表达 设计引物，ZO-1上游引物：5'-TGCTATTACACGGTCCTC-3'，下游引物5'-TGGTGCTCCTAAACAATC-3'，扩增长度为191 bp。occludin上游引物：5'-GACCACTATGAAACCGACTA-3'，下游引物：5'-CTCACTTCTCCAGCAACC-3'，扩增长度为411 bp。β-actin上游引物：5'-AGCCATGTACGTTAGCCATCC-3'，下游引物:5'-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3'，产物228 bp。分别对两组采用Trizol试剂一步法提取细胞RNA，逆转录合成cDNA，进行PCR 扩增。PCR 反应参数：94℃ 5 min，94℃ 30 s，62℃ 45 s，72℃ 30 s，共31个循环，72℃延伸5 min。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下拍照，用Bio-Rad 凝胶成像仪成像，用凝胶成像分析系统观察并分析结果。以β-actin为内参照行半定量分析。相对含量测定：用美国 Bio-Rad Gep doc 2000 凝聚胶成像分析系统对电泳条带进行灰度扫描并用Quantity One软件计算ZO-1/β-actin、occludin/β-actin的比值表示其相对含量。

1.3统计学方法 应用SPSS16.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1大鼠REVC的原代培养形态 倒置相差显微镜下观察原代培养的大鼠REVC生长情况。分离的大鼠REVC一般在24 h后贴壁,逐渐形成细胞团,细胞呈梭形,第3～5天细胞克隆样生长。12～15 d可呈铺路石状铺满培养皿成单层融合,存在明显的接触抑制。传代细胞生长活跃，5～7 d即可融合生长。见图1。

2.2大鼠REVC的免疫组化鉴定 大鼠REVC对Ⅷ因子相关抗体染色阳性，空白对照组则呈阴性。见图2。

图1 大鼠REVC原代培养24 h倒置显微镜下改变

图2 大鼠REVC对Ⅷ因子相关抗体染色阳性改变

2.3缓激肽对体外培养大鼠REVC间紧密连接屏障模型的影响 加入缓激肽的大鼠REVC间紧密连接屏障模型不同时间点的TER值差异有统计学意义(F=21.25，P<0.01)，实验组作用2 h的TER值(170.61±2.51)小于测量前(310.29±1.53)、4 h(298.35±2.86)和对照组(观量前300.16±5.19，作用2 h 298.34±5.88，作用4 h 300.34±5.43)(P<0.01)；实验组作用4 h、测量前和对照组无明显变化(P>0.05)。

2.4RT-PCR 法检测缓激肽对紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin mRNA表达的影响 见图3，表1。实验组作用2 h,ZO-1和occludin mRNA值小于测量前、4 h和对照组(P<0.01)；实验组作用4 h、测量前和对照组无明显变化(P>0.05)。

图3 RT-PCR检测ZO-1和occludin mRNA表达

表1 缓激肽对ZO-1和occludin mRNA表达的影响(±s,n=10)

与实验组2 h比较：1)P<0.01

3 讨 论

血视网膜屏障由相邻的REVC之间的紧密连接、周膜细胞及其之间的基膜组成，星形胶质细胞及Müller细胞的突起包绕其外，紧密连接是维持血视网膜屏障完整的基础〔1〕。缓激肽是自然存在于体内的小分子九肽，是激肽释放酶-激肽系统中一种主要的激肽类物质，既可引起病理生理反应，又可发挥生理保护作用，参与多系统器官的功能调节和病理生理过程，如心血管、肾脏、中枢神经系统的调节，葡萄糖代谢、细胞增殖、平滑肌收缩、炎症、疼痛、休克和组织损伤过程〔2〕。目前，缓激肽开放屏障的功能已经成为新的研究热点。Inamura等〔3〕在1994年首先发现小剂量缓激肽可以选择性开放血肿瘤屏障。刘丽波等〔4〕发现缓激肽可以开放脑胶质瘤大鼠血肿瘤屏障的紧密连接，增加血肿瘤屏障的通透性。王玉勤等〔5〕发现小剂量缓激肽可以通过开放紧密连接增加大鼠缺血区血脑屏障的通透性。Easton等〔6〕研究表明缓激肽可通过B2受体结合，引起Ca2+释放增加，从而激活磷脂酶A2和5-脂氧化酶，促进花生四烯酸的代谢，降低跨内皮细胞阻抗，开放血脑屏障的紧密连接。

目前针对缓激肽是否可以开放血视网膜屏障的研究还未见报道。本研究发现，给予缓激肽后，紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin mRNA表达减少，大鼠血视网膜屏障的通透性升高，证明缓激肽具有开放血视网膜屏障的功能。缓激肽开放血视网膜屏障的机制还不明确。紧密连接在结构上是一组蛋白原件构成的复合体，主要包括：①跨膜蛋白，主要由occludins，claudins，junction associated molecules等蛋白家族组成；②胞质附属蛋白，主要包括ZO-1，ZO-2，ZO-3，7H6等蛋白家族。细胞骨架蛋白F-actin是紧密连接形成胞旁屏障的重要因素，其几乎存在于每一处紧密连接的细胞膜上，用细胞松弛素破坏细胞骨架蛋白F-actin 亦可导致紧密连接的破坏。ZO-1是1986年发现的与紧密连接相关的蛋白，是构成紧密连接的重要成分之一,能与其同源体ZO-2、ZO-3一起,为紧密连接的许多跨膜蛋白和细胞质紧密连接蛋白搭建具有连接作用的脚手架样平台〔6〕。occludin是第一个被分离出来的紧密连接跨膜蛋白，由504个氨基酸残基组成，相对分子质量为6.5×104。occludin中长的C端富含丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基与ZO-1的PDZ结构域相连，依次和肌动蛋白骨架细胞相连。紧密连接相关蛋白彼此之间存在相互作用，维持紧密连接的完整性。而且，如果这些蛋白发生紊乱将会直接影响紧密连接的完整性，进而改变屏障的通透性。刘坤〔7〕发现缓激肽与罂粟碱伍用可以通过减少紧密连接相关蛋白claudin-5表达，增加血肿瘤屏障的通透性。刘丽波等〔8〕发现缓激肽可在转录水平上减少紧密连接相关蛋白occludin 和ZO-1 的表达，开放血肿瘤屏障。血视网膜屏障的超微结构与血脑屏障和血肿瘤屏障具有一定的相似性。因此认为，缓激肽开放血视网膜屏障、增加血视网膜屏障的通透性的机制，可能与在转录水平上减少紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin mRNA的表达水平、降低紧密连接相关蛋白occludin和ZO-1的表达有关。

1宋昊刚，崔 浩.血-眼屏障的作用及意义〔J〕.航空航天医学,2005;16(2):53-4.

2Ongali B，Hellal F，Rodi D，etal.Autoradiographic analysis of mouse brain kinin B1 and B2 receptors after closed head trauma and ability of Anatibant mesylate to cross the blood-brain barrier〔J〕.J Neurotrauma,2006;23(5):696-707.

3Inamura T，Black KL.Bradykinin selectively opens blood-tumor barrier in experimental brain tumors〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab,1994;14(5):862-70.

4刘丽波，杨智舫，刘 丽，等.缓激肽对脑胶质瘤大鼠紧密连接影响的形态学观察〔J〕.解剖科学进展，2007;13(3):226-9.

5王玉勤，安 平，薛一雪.缓激肽对大鼠缺血区血脑屏障的影响〔J〕.解剖科学进展，2005;11(2):95-8.

6Easton AS，Abbott NJ.Bradykinin increases permeability by calcium and 5-lipoxygenase in the ECV304/C6 cell culture model of the blood-brain barrier〔J〕.Brain Res,2002;953(2):157-69.

7刘 坤.紧密连接相关蛋白claudin-5在缓激肽与罂粟碱伍用开放血肿瘤屏障中的作用〔D〕.沈阳：中国医科大学,2008.

8刘丽波，薛一雪，王 萍.缓激肽对脑胶质瘤大鼠occludin和ZO-1 mRNA的调节和机制〔J〕.中国医科大学学报，2010;39(7):497-500.

〔2017-03-21修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

黑龙江省自然科学基金资助项目(No.H2015078)

闫 磊(1978-)，男，讲师，主要从事干细胞增殖与分化研究。

蔡克瑞(1980-)，女，讲师，主要从事衰老生物机制及中药抗衰老研究。

R329.2；R774.1

A

1005-9202(2017)16-3925-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.007