蒋科芳 盛阳 徐露 潘旭鸣 印媛君⋆

基于病证结合评价“两肾一夹”法和高盐饮食加灌附子汤法的高血压模型建立

蒋科芳 盛阳 徐露 潘旭鸣 印媛君⋆

目的 探究“两肾一夹”法和高盐饮食加灌附子汤法高血压模型与中医证型的符合度。方法 将32只SD大鼠随机分为4组：空白组、高盐饮食加灌附子汤组（中药造模）、假手术组、“双肾一夹”组（手术造模）。造模后21d观察大鼠尾动脉压、肾脏指数、行为学指标、肾脏病理学切片，统计研究结果。结果 与空白组比较，中药造模组大鼠血压值变化有显著性差异（P＜0.01）。与假手术组比较，手术造模组大鼠血压值均有显著性差异（P＜0.01）。中药造模组与手术造模组大鼠血压值无明显差异（P＞0.05）。与空白组比较，中药造模组造模后量表评分有显著性差异（P＜0.01）。与假手术组比较，手术造模组大鼠造模后量表评分无明显性差异（P＞0.05）。中药造模组与手术造模组大鼠造模后量表评分有显著性差异（P＜0.01）。与空白组比较，中药造模组造模后肾脏指数无明显差异（P＞0.05）。与假手术组比较，手术造模组大鼠造模后肾脏指数有显著性差异（P＜0.01）。中药造模组与手术造模组大鼠造模后肾脏指数有明显差异（P＜0.05）。与空白组比较，中药造模组大鼠左肾无明显变化。与假手术组比较，手术造模组左侧肾脏因供血不足发生明显固缩。中药造模组与手术造模组大鼠造模后肾脏固缩差异明显。与空白组大鼠比较，中药造模肾小球肾小管形态无差异；与假手术组比较，手术造模组肾小球萎缩。结论 “两肾一夹”法和“高盐饮食加灌附子汤法”均是有效的建立高血压模型的方法，但与“两肾一夹”法建立的高血压模型比较，高盐饮食加灌附子汤法的高血压模型更符合中医肝阳上亢证。

高血压 模型 病证结合

高血压是最常见的心血管疾病，中医证型［1］有心肾气虚﹑肝阳上亢﹑阴阳两虚﹑痰湿壅盛﹑痰热﹑瘀血阻络及其他共七大类。与人类疾病吻合的高血压模型的建立，可为中医药治疗高血压提供重要支撑，而中医药的疗效又有赖于明确辨证分型的建立。“两肾一夹”法和高盐饮食加灌附子汤法是目前建立高血压动物模型经典方法［2-4］，但两者与中医证型的符合度尚不明确。本实验通过比较“两肾一夹”法和高盐饮食加灌附子汤法建立不同的高血压模型，分析两种高血压模型与中医证型的符合度，从而探讨在病证结合时高血压模型建立的意义。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）药物：附子汤（由单味制附子20g，浸泡30min，总计煎煮90min，浓缩为200ml，含生药0.1mmol/L。购买自浙江中医药大学附属名医馆），10%水合氯醛，注射用青霉素钠，高浓度盐水（1.5%）。（2）动物：健康﹑雄性﹑清洁级SD大鼠，体重180～200g，购于浙江中医药大学动物实验中心，动物合格证号SCXK（沪）2013-2016。标准饲料喂养，适应环境1周后，供试验使用。（3）仪器：大鼠无创血压测定系统（上海奥尔特生物科技有限公司），动物恒温系统（上海奥尔特生物科技有限公司），GX-400精密电子天平（上海勤酬实业有限公司），无菌针灸针，规格：0.25×25mm；3/0﹑4/0医用真丝编织线（使用前均经高温高压蒸汽灭菌）。

1.2 实验方法 （1）术前准备及动物分组：所有实验大鼠均饲以常规固体饲料，自由饮水，在喂养适应1周后方开始实验。将拟用于实验大鼠随机分为4组：空白组（n=8）﹑中药造模组（n=8）﹑假手术组（n=8）和手术组（n=8）。（2）基础血压测定：测量环境安静﹑恒温（28℃），测量所有大鼠尾动脉收缩压为基础血压。（3）模型建立：手术建模参照文献［5］：用10%的水合氯醛（0.4ml/100g）腹腔注射麻醉SD大鼠，仰卧固定于手术台上，四肢和牙齿用橡皮筋固定。用棉签蘸脱毛剂涂抹在SD大鼠腹部，3～5min后用棉签擦去脱下的毛和脱毛剂。5%碘伏消毒腹部，75%酒精脱碘，盖上孔巾沿腹正中线作手术切口打开腹腔，按无菌操作，小心﹑钝性分离出左肾动脉，然后穿入无菌丝线，将直径为0.25mm的针灸针与肾动脉血管长轴紧贴平行放置，用无菌丝线扎紧肾动脉和针灸针，然后抽出针灸针，结果造成单侧肾动脉狭窄。假手术组只打开腹腔，分离左肾动脉后关腹。术后给予2%氯化钠水溶液，术后3d青霉素治疗（3×104U/d）。中药建模参考文献［2-3］，附子汤+高浓度盐水综合法造模。用2g/（kg·d）附子汤灌胃大鼠，同时予高浓度盐水（1.5%）饮水3周。造模处理后凡血压比处理前高20mmHg（大于正常血压3个标准差）以上且＞115mmHg者确认为高血压模型形成。造模过程中密切观察大鼠行为学指标。（4）血压测量：造模后21d用尾套法测量大鼠血压，重复3次取其均值。（5）行为学指标观察：观察大鼠行为学指标，主要是毛色是否光泽，双眼结合膜颜色是否加深变红，饮水量，体重增长情况以及易激惹程度的变化（总分≥9即模型成功）。（6）肾脏指数的测定：取右侧肾脏，剥离肾膜，滤纸吸干水分，分别称重即得右肾重量（RKW），计算右肾脏重量指数（RKW/ BW）。（7）右肾病理学观察：取大鼠右侧肾脏，取部分肾脏去除包膜，用生理盐水冲洗，去除血液，并用滤纸拭干，部分放入4%甲醛溶液中固定，石蜡包埋，连续切片，HE染色。

1.3 统计学方法 采用SPSSl7.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模前后各组大鼠尾动脉收缩压比较 见表1。

表1 造模前后各组大鼠尾动脉收缩压比较［mmHg，］

表1 造模前后各组大鼠尾动脉收缩压比较［mmHg，］

注：与空白组比较，*P＜0.01；与假手术组比较，#P＜0.01

组别n造模前造模后造模前后差值空白组8122.25±10.38122.62±10.703±1.06中药造模组8116.75±8.36172.75±5.80 *56±9.30假手术组8117.5±11.88115.5±8.56-2±4.93手术造模组8124.75±6.73174.5±6.76#49.75±8.68

2.2 造模后各组大鼠行为学量表得分比较 见表2。

表2 造模后各组大鼠行为学量表得分比较［分，］

表2 造模后各组大鼠行为学量表得分比较［分，］

注：与空白组比较，*P＜0.01

组别n造模前造模后差值空白组80.88±0.830.75±0.71-0.12±1.23中药造模组80.375±0.529.88±0.83*9.5±0.76假手术组80.75±0.711±0.530.25±0.89手术造模组80.75±0.710.63±0.52-0.13±0.99

2.3 造模后各组大鼠肾脏指数比较 见表3。

表3 造模后各组大鼠肾脏指数比较［mg/g，］

表3 造模后各组大鼠肾脏指数比较［mg/g，］

注：与中药造模组比较，*P＜0.05；与假手术组比较，#P＜0.01

组别n体重（BW）右肾湿重（RKW）RKW/BW空白组8200.75±7.551.17±0.15.87±0.54中药造模组8122±3.821.22±0.66.01±0.42假手术组8190.75±10.361.21±0.106.38±0.72手术造模组8181.75±7.751.33±0.11*#7.32±0.77

2.4 各左侧肾固缩情况比较 肾脏固缩程度［6］分为完全固缩即肾脏全部钙化变为白色；部分固缩即肾脏未全钙化，部分尤其是靠近肾门部分的组织还是鲜红色；无固缩即整个肾脏只发生缩小的变化，无钙化发生。与空白组比较，中药造模组大鼠左肾无明显变化（P＞0.05）。与假手术组比较，手术造模组左肾固缩明显（P＜0.01）。与中药造模组比较，手术造模组左肾固缩非常明显（P＜0.01）（见图1﹑2，表4）。

图1 各组左肾形态

图2 手术组左肾切片

表4 造模后各组大鼠左肾固缩情况（n/%）

2.5 病理结果 与空白组大鼠比较，中药造模肾小球肾小管形态无明显差异。与假手术组比较，手术造模组肾小球萎缩，部分肾小球代偿性肥大，肾间质可见大量炎症细胞和红细胞浸润等（见图3）。

图3 各组大鼠肾组织变化（HE×100）（A：空白组；B：中药造模

3 讨论

中医药在高血压治疗上有独特优势，而辨证论治是其取效的关键与特色。因此，中医药研究的动物模型宜采用病证结合的方式。“两肾一夹”法和高盐饮食加灌附子汤法是目前建立高血压动物模型相对成熟﹑便捷的方法。通过对比这两种造模方法与中医证型的吻合度，无疑是高血压病证结合模型建立的有益探索。“两肾一夹”法是将大鼠一侧肾脏肾动脉结扎，由于结扎侧肾脏缺血而造成肾素增多，肾素-血管紧张素系统激活，蓄积的肾素释放到循环血液中，催化血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）生成，导致血压升高［13］，而于神经系统的兴奋作用不明显。所以手术造模组大鼠出现血压升高；造模后因血流量减少，左肾固缩明显，镜下钙化；右肾肾脏指数明显高于假手术组，表明右肾代偿性增大，且镜下发现肾小球萎缩。但无明显躁动的行为表现，且大鼠造模后被毛紧凑，毛色有光泽，双眼结合膜颜色无明显变化；饮水量无明显变化。按筛选量表得到该组大鼠评分明显＜9分，不符合肝阳上亢证。

中药造模法通过高盐饮食让大鼠摄入过多盐，使其体内出现水钠潴留，导致动脉血压升高。同时水钠潴留还将增加血管紧张性，促进去甲肾上腺素的释放，使血压进一步升高。附子中的去甲乌药碱通过激动α受体，增强心肌收缩力和心输出量，升高血压。附子中多种成分能直接作用于神经，兴奋下丘脑CRH神经细胞，引起亢奋。所以中药造模组大鼠明显血压升高，出现提尾时尖叫﹑惊跳甚至咬人或同笼大鼠频繁打斗等躁动现象，且造模后被毛蓬松，毛色渐暗，双眼结合膜颜色加深变红；饮水量明显增多，消瘦明显。该组大鼠按筛选量表评分均≥9分，符合肝阳上亢证。从中医机理分析，因咸入肾，但咸味太过，则以喜为恶，反补为泻，伤及肾阴，又因肝肾同源，肾虚日久则肝肾阴液俱亏。附子大辛大热，过服易灼伤津液，造成肝肾阴精亏虚。阴不制阳，肝阳偏盛，出现一派热甚烦躁之象。

“两肾一夹”法作为实验研究经典造模方法，但在本实验中发现该法所得的模型虽然满足单纯高血压病，但不满足中医肝阳上亢证的标准。与“两肾一夹”法比较，高盐饮食加灌附子汤法的高血压模型更符合中医肝阳上亢证，可为中医药治疗肝阳上亢型高血压提供重要支撑。

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Objective To study the “two-kidney one-clip”（2K1C）hypertension model in mice and high-salt diet combined with Aconite decoction to build hypertension model conformity in TCM liver Yang hyperactivity syndrome type. Methods Thirty-two Sprague Dawley（SD）rats were randomly divided into empty group，high-salt diet combined with Aconite decoction group（TCM made model group），sham operation group，“double-kidney one-clip” method group（surgery made model group）. The rat models were evaluated thereafter by rats tail arterial pressure detection，kidney index，symptoms and signs observation，kidney pathology biopsy，and statistical methods of statistics processing. Results Compared with empty group，the change of blood pressure in TCM made model group was of signifi cant difference（P＜0.01）；compared with sham operation group，the change of blood pressure in surgery made model group was of signifi cant difference（P＜0.01）. No obvious difference was found between TCM made model group and surgery made model group（P＞0.05）；compared with empty group，the scores of TCM made model group after modeling was of signifi cant difference（P＜0.01）；compared with sham operation group，the scores of surgery made model group after modeling had no obvious difference（P＞0.05）.The scores of TCM made model group had signifi cant difference（P＜0.01）；compared with empty group，the kidney index in TCM made model group had no obvious difference（P＞0.05）；compared with sham operation group，the kidney index in surgery made model group was of signifi cant difference（P＜0.01）.There's signifi cant difference between TCM made model group and surgery made model group（P＜0.01）；compared with empty group，the pyknic situation in TCM made model group had no obvious change；compared with sham operation group，the pyknic situation in surgery made model group was obviously shrank. There's signifi cant difference between TCM made model group and surgery made model group；compared with empty group，there were no differences in the morphology of glomerular tubular；compared with sham operation group，surgery made model group appeared glomerular atrophy. Conclusion The “2K1C”hypertension model and the high-salt diet combined with Aconite decoction hypertension model are both successful Hypertension modules，but compared with the “2K1C” hypertension model，the high-salt diet combined with Aconite decoction hypertension model is more accordant with TCM liver-Yang hyperactivity syndrome type.

Hypertension Modules Combination of diseases and syndrome

310053 浙江中医药大学第一临床医学院*通信作者