王日军 王敬萍 徐继尧 刘佳 郭彦青

基础研究

姜黄素对缺血再灌注损伤大鼠心肌线粒体呼吸链的影响

王日军 王敬萍 徐继尧 刘佳 郭彦青

目的 探讨姜黄素对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌梗死面积及心肌线粒体呼吸链的影响。方法 采用健康雄性Wister大鼠（n=24）建立Langendorff离体心脏灌注模型，分为3组，正常对照组、缺血再灌注组和姜黄素预处理组。正常对照组持续灌注90 min；缺血再灌注组全心缺血30 min，再灌注60 min；姜黄素预处理组加入姜黄素（0.2 mmol/L）后，全心缺血30 min，再灌注60 min。再灌注结束后，TTC染色观察心肌梗死面积，应用紫外分光光度法测定缺血再灌注后心肌线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ的活性。结果 ①缺血再灌注组心肌坏死面积约为（26.9±2.5）%。经姜黄素预处理后，心肌梗死面积为（21.8±2.2）%，较缺血再灌注组明显降低，差异有统计学意义。②缺血再灌注组心肌线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ活性分别为0.453±0.069、0.050±0.005，姜黄素预处理组心肌线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ活性分别为0.565±0.071、0.059±0.004，较缺血再灌注组均显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 姜黄素预处理能够缩小心肌梗死面积，同时增加线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ的活性，从而对缺血再灌注损伤心肌起保护作用。

姜黄素； 心肌缺血； 再灌注损伤； 线粒体呼吸链

心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）是指心肌组织在较长时间缺血后恢复血液灌流，反而出现比再灌注前更明显、更严重的损伤和功能障碍，包括收缩功能降低、冠脉流量下降及血管反应性改变[1]。心肌缺血再灌注损伤是心血管疾病患者死亡的主要原因之一[2,3]，目前仍是困扰临床医生的一大常见难题。如何保护缺血心肌免于再灌注损伤成为当前重要的研究内容之一。姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄根茎中提取的一种酚类色素，也是一种天然抗氧化剂。研究表明[4,5]，姜黄素预处理可通过减少炎症反应和氧化应激，改善心肌缺血再灌注损伤，对心肌缺血再灌注损伤有较好的保护作用，但具体作用机制尚不明确。线粒体是供氧的重要能量来源，人体80%以上的能量由线粒体氧化磷酸化供应，良好的线粒体功能对于维持心肌功能至关重要。研究显示[6]，线粒体已成为缺血再灌注损伤心肌损伤的主要参与者和调节器。本实验采用姜黄素干预心肌缺血再灌注损伤大鼠，研究姜黄素对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌梗死面积及线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ活性的影响，探讨其具体作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂 24只健康雄性Wistar大鼠购自北京大学医学部实验动物科学部，体质量300~350 g。实验期间以常规鼠饲料喂养，自由摄食、饮水，动物房温度维持在（22±3）℃，相对湿度为（50±20）%。姜黄素购自Sigma公司，用6%乙醇和6%聚乙二醇400的水溶液溶解。线粒体呼吸链复合体酶Ⅰ、Ⅳ活性检测试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司。乙醚、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、葡萄糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等购自天津市福晨化学试剂厂。

1.2 Langendorff离体心脏灌注模型的制备

1.2.1 灌注装置 Langendorff离体心脏灌注装置主要由心脏保温室、恒温加热管、恒温水浴箱和恒流泵组成。利用恒温水浴箱中的恒温水流保持灌注液和心脏保温室的温度在（37.0±0.5）℃。

1.2.2 灌注液 Krebs液 （mmol/L）：NaCl 118.0，KCl 4.7，NaHCO325.0，CaCl22.5，MgSO41.2，KH2PO41.2，丙酮酸钠 2.0，葡萄糖 11.0。Krebs灌注液配制后，用0.45 μm的滤膜过滤。灌注前向Krebs灌注液中持续通入95%O2和5%CO2混合气体。

1.3 分组及给药 将24只Wistar大鼠随机分成3组：正常对照组、缺血再灌注组和姜黄素预处理组，每组8只。正常对照组持续灌注90 min；缺血再灌注组全心缺血30 min，再灌注60 min；姜黄素预处理组加入姜黄素（0.2 mmol/L）后，全心缺血30 min，再灌注60 min。

大鼠乙醚吸入麻醉，在其股动脉注入3 U/g肝素抗凝，迅速沿着剑突下肋缘剪开腹壁，沿两侧腋前线剪开胸壁，于心脏根部保留主动脉3～4 mm剪下心脏，立即放入4℃ Krebs液中，主动脉插管，左心房套管，固定于Langedorff灌流柱口，灌流压恒定于10 kPa，观察心脏自主搏动情况。Krebs液的氧分压维持在66.7～73.3 kPa，二氧化碳分压维持在4.8～5.6 kPa，pH 值为 7.35～7.45。整个灌流系统及心脏周围用恒温水浴循环器维持在36.5℃～37.5℃，用Krebs液平衡灌流5 min后，心脏搏动达到稳定状态，开始进一步实验。

1.4 标本取材过程 灌注末从灌流装置摘取心脏，称质量，剪碎，按1∶7加入蔗糖咪唑（300 mmol/L蔗糖，10 mmol/L咪唑，pH 7.4，4 ℃），在冰上充分匀浆，匀浆液在4℃条件下，3000 r/min差速离心10 min后弃沉淀留上清，上清液10 000 r/min离心20 min，2次，沉淀即为线粒体。其中上清液24 000 r/min超速离心30 min，弃沉淀留取上清液，上清及线粒体-70℃冷冻备用。应用Folin酚法测定各组上清和线粒体液蛋白含量。

1.5 心肌梗死面积测定 自灌注装置摘取大鼠心脏，用4℃生理盐水冲洗后，剪去心房、血管及脂肪组织，-20℃冻存10 min。将心室切成厚度约1 mm的薄片，立即置入1%TTC磷酸盐缓冲液（pH 7.4），于37℃避光染色30 min。用超纯水冲洗心肌切片3次，再置入10%甲醛溶液中固定12 h，以增强颜色对比。使用数码照相机采集图像，用Scion image软件分析。按下列公式计算心肌梗死面积与总面积的百分比：心肌梗死面积（%）=未着色面积/心肌片总面积×100%。

1.6 心肌线粒体呼吸链复合体酶Ⅰ、Ⅳ活性的检测 按照上海杰美基因医药科技有限公司试剂盒说明书，采用分光光度法分别在340 nm（复合体酶Ⅰ）和550 nm（复合体酶Ⅳ）处测定。心肌线粒体呼吸链复合体酶Ⅰ比活性=[（△A样品-△A背景）×样品稀释倍数]/[0.1（样品质量，mg）×6.22]/线粒体蛋白浓度。心肌线粒体呼吸链复合体酶Ⅳ比活性=[（△A 样品-△A 背景）×样品稀释倍数]/[0.1（样品质量，mg）×21.84]/线粒体蛋白浓度。以牛血清白蛋白为标准，应用Folin-酚法测定各组线粒体蛋白浓度。

1.7 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件进行数据处理。计量资料以±s表示，多样本组间比较采用单因素方差分析，方差齐时采用q检验，方差不齐时采用Tamhane检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TTC结果 全心缺血30 min，再灌注60 min后，心肌坏死程度即TTC染色阴性区域约为26.9%。经姜黄素预处理后，心肌梗死面积为21.8%，明显低于缺血再灌注心肌，提示姜黄素能够减轻心肌缺血性损伤，使心肌梗死面积减少了5.1%。见表1。

表1 姜黄素对缺血再灌注损伤大鼠心肌梗死面积的影响（±s）

表1 姜黄素对缺血再灌注损伤大鼠心肌梗死面积的影响（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.01；与缺血再灌注组比较，bP＜0.01

组别 例数 心肌梗死面积（%）正常对照组 8 0缺血再灌注组 8 26.9±2.5a姜黄素预处理组 8 21.8±2.2ab

2.2 姜黄素对线粒体呼吸链复合体酶活性的影响 与缺血再灌注组相比，姜黄素预处理组线粒体呼吸链复合体酶Ⅰ（CI）、线粒体呼吸链复合体酶Ⅳ（CIV）活性均显著增加（P＜0.05），见表2。

表2 姜黄素对线粒体呼吸链复合体酶CI、CIV 活性的影响（±s）

表2 姜黄素对线粒体呼吸链复合体酶CI、CIV 活性的影响（±s）

注：CI：线粒体呼吸链复合体酶Ⅰ；CIV：线粒体呼吸链复合体酶Ⅳ。与对照组比较，aP＜0.01；与缺血再灌注组比较，bP＜0.01

组别例数CI（ukat/g）CIV（ukat/g）正常对照组 8 0.614±0.079 0.068±0.006缺血再灌注组 8 0.453±0.069a 0.050±0.005a姜黄素预处理组 8 0.565±0.071ab 0.059±0.004ab

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤是临床上缺血性心脏病、休克、体外循环心血管手术等各种疾病和治疗过程中常见的病理损伤[7]。氧自由基过度产生是心肌缺血再灌注损伤的特征之一，是心肌缺血再灌注发展为不可逆阶段的重要原因[8]。氧自由基作为单电子化合物，具有很高的活性，主要攻击生物膜上的不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化，可改变呼吸链复合体酶的结构，使呼吸链受损。近年来，对呼吸链在缺血再灌注损伤中的作用进行了深入的研究，认为线粒体呼吸链对缺血再灌注损伤有重要作用[9]。其中，呼吸链复合体酶Ⅰ、Ⅳ在能量代谢中起着非常重要的作用，其活性变化可直接或间接反映线粒体呼吸功能的变化。而且线粒体呼吸链的损伤主要发生在缺血期而不是再灌注期，因此改善缺血期线粒体呼吸链复合体酶的活性可以更好地保存再灌注后心肌功能。文献报道[10,11]，姜黄素作为一种天然抗氧化剂，具有较强的抗自由基、抗脂质氧化、稳定细胞活性的作用，对心肌缺血再灌注损伤有较好的保护作用，但其作用机制尚不明确。本实验通过姜黄素预处理来研究呼吸链在心肌缺血预处理中的保护作用，进一步探讨呼吸链在缺血再灌注损伤中的作用。本研究制作了心肌缺血再灌注模型，结果显示，与正常对照组相比，缺血再灌注组和姜黄素处理组心肌梗死面积均明显扩大，同时线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ的活性显著下降，这说明离体大鼠心脏已出现了明显的心肌梗死表现，线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ的活性下降对其有促进作用。与缺血再灌注组相比，采用姜黄素预处理后，心肌梗死面积有所减少，同时线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ的活性显著增强，差异有统计学意义，这说明姜黄素预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤有保护作用，可通过增强线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ的活性为心肌细胞提供能量，以减轻其损害，从而减小心肌坏死面积。González-Salazar等[12]的研究采用姜黄素灌胃法处理缺血再灌注损伤大鼠，虽给药方式与本实验有所差异，但实验也表明姜黄素可通过减轻氧化应激反应及改善线粒体功能障碍起到改善心肌缺血再灌注损伤，研究结果与本实验相似。而Duan等[13]的实验表明，姜黄素处理后可通过活化JAK2/STAT3信号通路对心肌缺血再灌注产生保护作用。此外，也有研究[14,15]证明，姜黄素预处理可通过激活SIRT1、Nrf2同时失活NF-κB起到减轻心肌缺血再灌注损伤的作用。总之，姜黄素减轻心肌缺血再灌注损伤具有多重作用机制，需进一步深入探讨方能对临床治疗起到一定的指导作用。

综上所述，姜黄素可以增加离体大鼠心脏缺血再灌注损伤时心肌线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ的活性，从而减小心肌梗死面积，对缺血再灌注心肌损伤有保护作用，这也许是姜黄素改善大鼠心肌缺血再灌注损伤的一种分子机制。其具体作用途径尚需进一步研究探讨。

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Effects of curcumin on myocardial mitochondria respiratory chain in rats with myocardial ischemia reperfusion injury

WANG Ri-jun，WANG Jing-ping，XU Ji-yao，et al.Department of Cardiology，Cardiovascular Hospital of Shanxi Province，Taiyuan 030024，China

GUO Yan-qing，E-mail：azgyq@sohu.com

ObjectiveTo investigate the effect of curcumin on myocardial mitochondria respiratory chain in rats with myocardial ischemia reperfusion injury.MethodsTwenty-four healthy male Wistar rats were used in the Langendorff isolated heart perfusion system.The hearts were randomly divided into three groups:control group，ischemia-reperfusion（I/R）group and curcumin-pretreated group，with eight rats in each.The hearts in control group were perfused 90 min.The hearts in ischemia-reperfusion（I/R）group were subjected to 30 min of global ischemia and 60 min of retrograde reperfusion.The hearts in dantrolene-treated group were perfused for 20 min in the working mode，in the presence of curcumin，and then were subjected to 30 min of global ischemia and 60 min of reperfusion.After the reperfusion,the myocardial infarct size was determined by the TTC staining，and the activity ofⅠandⅣin myocardial mitochondrial respiratory chain complex was determined by UV spectrophotometry.ResultsCompared with group ischemia reperfusion，curcumin pretreatment decreased ischemia reperfusion myocardial infarction area[（26.9±2.5）%vs（21.8±2.2）%].Compared with group ischemia reperfusion，the activities of myocardial mitochondrial respiratory chain complexⅠ andⅣ were increased in group curcumin（0.453±0.069 vs 0.565±0.071，0.050±0.005 vs 0.059±0.004），the difference was statistically significant（P＜0.05）.ConclusionCurcumin pretreatment can reduce the myocardial infarct size，and increase the activity of mitochondrial respiratory chain complexⅠandⅣ,so as to protect the myocardium from ischemia reperfusion injury.

Curcumin； Myocardial ischemia； Reperfusion injury； Mitochondrial respiratory chain

030024 山西省太原市，山西省心血管病医院心内科

郭彦青，E-mail：azgyq@sohu.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2017.04.022

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2017）04-0377-04

2016-11-24）