王丽月 刘艳 薛晋红 王文香 贺忠梅

基础研究

DMOG稳定缺血/再灌注心肌组织低氧诱导因子-1α表达时间规律的研究

王丽月 刘艳 薛晋红 王文香 贺忠梅

目的 观察二甲氧乙二酰甘氨酸（DMOG）预处理对大鼠缺血再灌注（I/R）心肌组织中低氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达的影响，探讨DMOG稳定HIF-1α表达的时间规律。方法 雄性Wistar大鼠随机分为假手术组（Sham组）、心肌缺血再灌注组（MI/R组）、DMOG+MI/R组、YC-1+MI/R组（YC-1为HIF-1α抑制剂）。建立心肌缺血/再灌注模型，心肌缺血45 min，再灌注0 h、3 h、6 h、9 h四个时间点。留取心脏左室前壁标本，分别采用Western blot和Real-time PCR法检测心肌组织中HIF-1α蛋白与mRNA表达水平。结果

①再灌注相同时间点，D+MI/R组的HIF-1α蛋白表达量均明显高于MI/R组；在观察时间内，D+MI/R组的HIF-1α蛋白表达量呈现出先增高、后降低的趋势，并且在再灌注3 h时达峰值（P＜0.05）。②HIF-1α的mRNA表达量在不同组间及再灌注各个时间点均无明显差异（P＞0.05）。结论 DMOG预处理能够稳定心肌I/R时HIF-1α的蛋白表达量，峰值出现于再灌注3 h，而对HIF-1α的mRNA表达量无明显影响，表明这种作用主要发生于蛋白合成过程，而非基因转录水平。

低氧诱导因子-1α； 二甲氧乙二酰甘氨酸； 心肌缺血/再灌注损伤

缺血性心脏病（ischaemic heart disease，IHD）即心肌供血发生障碍而引起的心脏病，其发病率和死亡率居全球首位[1]。临床上主要采取溶栓、冠脉搭桥、经皮冠状动脉介入等再灌注疗法恢复缺血心肌的血运重建[2]，然而由此带来的再灌注损伤是造成心肌梗死、心肌细胞丢失的重要原因，并且可使20%的患者发生心力衰竭[3]。近年来研究发现，缺血预处理和后处理等机械性调控措施对心肌缺血/再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury，MI/RI）具有保护作用，并且是通过上调低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）表达来实现的[4]。

HIF-1广泛存在于哺乳动物组织细胞中，是对氧敏感的一种核转录因子，能促进机体对缺氧刺激作出适应性反应，且HIF-1的生理活性主要取决于受氧浓度调节的α亚基[5]。HIF-1α可通过调控下游靶基因的转录激活来促进细胞的存活[6]。然而，在常氧环境中，胞浆中HIF-1α易被脯氨酸羟化酶（Proline Hydroxylase，PHD）羟化修饰，经泛素化途径降解失活，使HIF-1α在再灌注时期难以发挥心肌保护作用。因此，研究者多采用PHD抑制剂二甲基乙二酰基甘氨酸（Dimethyloxalyglycine，DMOG）稳定HIF-1α表达，使HIF-1α对心肌的保护效应得以持续[7]。但是目前对心肌缺血/再灌注模型中HIF-1α的表达变化特点及DMOG稳定HIF-1α表达的时间规律尚不清楚，因此，本研究拟对这一问题进行探讨，以确定HIF-1α表达的最佳时间点，为实验中取材时间点的选择及后续HIF-1α的功能研究提供基础实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 选取8周龄，健康雄性Wistar大鼠78只，体重220～260 g（山西医科大学动物实验中心提供）。DMOG购自Sigma-Aldrich公司；YC-1购自 Cayman Chemical公司；HIF-1α一抗购于Santa Cruz公司；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购于上海碧云天技术有限公司；Real-Time PCR试剂盒购于Thermo Fisher Scientific公司；HX-200动物呼吸机（成都泰盟科技有限公司）；Mx3005P型荧光定量PCR仪（吉泰生物科技有限公司）；电泳仪、半干转膜仪、PTC-100型PCR仪（BIO-RAD）。

1.2 实验分组和再灌注方案 将78只健康雄性Wistar大鼠随机分为4组：①假手术组（Sham，n= 6）；②心肌I/R组（MI/R，n=24）；③DMOG+心肌I/ R组（D+MI/R，n=24），术前24 h腹腔注射DMOG（40 mg/kg）；④YC-1+心肌I/R组（YC-1+MI/R，n= 24，YC-1为HIF-1α抑制剂），缺血前30 min尾静脉注射YC-1（2 mg/kg）。再灌注方案：Sham组除外，其余三组均心肌缺血45 min再灌注0 h、3 h、6 h和9 h。

1.3 实验方法

1.3.1 制备大鼠心肌缺血/再灌注模型 采用我们曾报道的方法建立模型[8]，心电图示ST段明显抬高，左心室前壁由红色明显变暗，说明缺血成功。45 min后松开止血钳冠脉血流恢复后，心电图示ST段回落明显，提示心肌再灌注成功。达到再灌注时间后处死动物，留取心脏左室前壁组织标本。

1.3.2 Western blot法检测心肌组织HIF-1α蛋白表达量 组织匀浆提取心肌组织总蛋白，BCA法蛋白定量后，上样待测样品50μg进行电泳，120min后半干转膜（15 V，15min），封闭2 h，孵育一抗（1∶1000），4℃过夜，洗涤后孵育二抗（1∶500）1 h，洗涤后采用化学发光法显影拍摄，曝光条带。采用Image J软件分析，以HIF-1α的灰度值与β-actin的灰度值的比值表示HIF-1α蛋白的相对含量。

1.3.3 Real-time PCR法检测心肌组织中HIF-1α的mRNA表达量 ①提取心肌组织总RNA：用Trizol总RNA提取试剂盒提取并纯化置于-20℃备用。②cDNA的合成：采用Oligo（dT）18 primer反转录反应液，65℃孵育5min，冰上冻存。采用10Mm dNTPMix，根据说明书在20μl RT反应体系中进行转录，仪器参数设置为42℃、60min，70℃、5 min。③心肌组织中HIF-1αmRNA表达量的检测：应用Maxima SYBR Green/ROX Qpcr Master Mix（2×）12.5μl，上、下游引物各0.3μM，Template DNA≤500 ng，Water nuclease-free配制成25μl PCR反应液，50℃2 min，95℃10min，1个循环；95℃15 s，60℃60 s，40个循环。置于荧光定量PCR仪中进行扩增及定量分析。引物序列 HIF-lα（NM_024359）：Forward：5′-ACT GAT TGC ATC TCC ACC TTC T-3′；Reverse：5′-TCG CTT CCT CTG AGC ATT CT-3′。引物序列 β-actin（NM_031144）：Forward：5′-GGC TAC AGC TTC ACC ACC AC-3′；Reverse：5′-TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG-3′。

2 结果

2.1 心肌I/R后HIF-1α蛋白表达变化趋势

HIF-1α的蛋白表达量在MI/R组0 h时明显高于Sham组（1.55±0.17比1.0±0.11，P＜0.01），之后的再灌注各时间点则呈逐渐降低趋势；再灌注0 h的HIF-1α蛋白表达量最高，分别为3 h、6 h、9 h的1.3倍、13.2倍、10.4倍（P＜0.01）。见图1。

图1 M I/R组再灌注各时间点HIF-1α蛋白表达量

2.2 DMOG预处理对大鼠心肌I/R后HIF-1α蛋白表达量的影响 与MI/R组相比，D+MI/R组在再灌注各个时间点的HIF-1α蛋白表达量均明显增加，0 h增加1.35倍（P＜0.05），3 h、6 h、9 h时分别为3.9倍、7.7倍、5.0倍（P＜0.01），提示DMOG预处理能够稳定再灌注时HIF-1α的蛋白表达。D+ MI/R组各时间点的HIF-1α蛋白表达量在再灌3 h时为峰值，分别为0 h、6 h、9 h的1.5倍、1.2倍、1.4倍（P＜0.05）。见图2。

图2 D+M I/R组不同时间点HIF-1α的表达量均增高，且3 h达峰值

2.3 各种处理因素对HIF-1α蛋白表达量的影响

与Sham组同一时间点的HIF-1α蛋白表达量相比,MI/R组表现为先高后低的趋势，而采用DMOG预处理则使HIF-1α的蛋白表达量明显增加,HIF-1α抑制剂YC-1则明显阻止了缺血/再灌注所致的HIF-1α表达。见图3。

图3 各种处理因素对HIF-1α蛋白表达水平的影响

2.4 各组不同时间点HIF-1αmRNA的表达水平比较 与Sham组相同时间点的HIF-1αmRNA表达量相比，MI/R组、D+MI/R组及YC-1+MI/R组均无显著差异（P＞0.05），且各组内任意两个时间点间也无明显差异（P＞0.05）。见表1。

表1 各组不同时间点HIF-1αm RNA的表达水平（±s）

表1 各组不同时间点HIF-1αm RNA的表达水平（±s）

组别 例数 HIF-1αmRNA 0 h 3 h 6 h 9 h Sham 6 1.05±0.04 1.02±0.03 1.00±0.08 1.03±0.04 MI/R 6 1.05±0.07 0.99±0.06 1.03±0.09 0.99±0.07 D+MI/R 6 1.00±0.07 1.02±0.07 1.00±0.04 1.02±0.09 YC-1+MI/R 6 1.09±0.07 0.98±0.06 1.03±0.01 1.04±0.03

3 讨论

本研究观察了DMOG预处理对I/R心肌组织中HIF-1α表达量的影响及时间规律，结果发现，在再灌注0～9 h时间内，DMOG可稳定HIF-1α的蛋白表达，表现为先增高后降低的趋势，并且在再灌注3 h时为峰值；而HIF-1α的mRNA表达量在同样时间内无明显变化，说明DMOG稳定HIF-1α的表达主要发生于蛋白合成过程，而非基因转录水平。本实验结果与Bruick等[9]的报道一致。DMOG为PHD的非特异性抑制剂，作用于已合成的HIF-1α，避免其受PHD羟化降解，但并不促进HIF-1α的合成。

HIF-1α作为对氧敏感的转录因子，在常氧环境中可被泛素化后快速降解，而缺氧条件下降解减少并大量积聚并转运至胞核，诱导下游与葡萄糖代谢、细胞增殖、新生血管生成等新陈代谢功能密切相关的基因，如VEGF、GLU1等的转录激活来介导组织细胞在缺血缺氧时的能量和代谢改变，从而促进机体对缺氧环境的适应[10]。鉴于这种生理特性，HIF-1α在缺血再灌注心肌组织中呈低表达状态，再灌注时难以发挥心肌保护作用。Ockaili等[7]首次采用DMOG稳定HIF-1α的蛋白表达，并观察到心肌梗死面积明显减小，从而为HIF-1α的研究开辟了一条新途径。

已有研究表明，使用DMOG可以抑制心肌细胞凋亡，改善心肌纤维化，该心肌保护作用依赖于HIF-1α对下游因子NF-κB的激活[11]。同时有报道DMOG预处理可稳定心肌组织中HIF-1α的蛋白表达，通过对HIF-1α下游基因如HO-1的激活，进而抑制炎症反应，改善左室功能，减轻MI/R损伤[12]。既往研究多采用DMOG稳定HIF-1α的表达来探究HIF-1α对心肌的保护机制，但在不同研究中，DMOG在实验对象体内的半衰期和作用时效有所不同，尚无统一定论，因此给实验中取材时间点的选择带来困扰。本研究发现，DMOG稳定HIF-1α蛋白表达的最佳时间点为再灌注3 h，可为HIF-1α功能研究中取材时间点的选择提供实验依据。

心肌缺血再灌注损伤所致的心肌细胞死亡和心功能障碍，是诱发心律失常、心衰和患者死亡的主要原因。近年的研究表明，缺血预处理能够减少心肌细胞凋亡和心梗面积，改善MI/R损伤，该心肌保护作用有赖于HIF-1α的激活[13]，在细胞水平上的研究也表明HIF-1α为介导缺血预适应心肌保护效应的关键因子[14]。而外源性给予DMOG稳定HIF-1α的表达可明显减轻心肌I/R损伤[15]，从而提示DMOG可能作为缺血性心脏病经临床治疗后的辅助药物来减轻再灌注损伤。尤为重要的是HIF-1α为机体内源性物质，药物干预容易对其浓度进行调控，有利于探究HIF-1α对机体的保护作用，因此本研究可为以HIF-1α为靶点的心脏保护药物的研发提供基础的实验数据。

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The time regularity of hypoxia inducible factor-1αexpression after DMOG pretreatment in m yocardial ischem ic/reperfusion model

WANG Li-yue，LIU Yan，XUE Jin-hong，et al.Department of Physiology，School of Basic Medical Sciences，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

HE Zhong-mei，E-mail：hezmei@126.com

ObjectiveTo explore the time regularity of hypoxia inducible factor-1α（HIF-1α）expression after pretreatment with DMOG by observing the dynamic expression changes at HIF-1αprotein and mRNA levels in myocardial ischemia/reperfusion model.Methods A total of 78 male Wistar rats were randomly divided into 4 groups：Sham，MI/R，DMOG+MI/R，YC-1+MI/R（YC-1，inhibitor of HIF-1α）.The I/R model was established by 45 min of left anterior descending artery（LAD）occlusion with the subsequent reperfusion at four different time points：0 h，3 h，6 h，9 h.Left ventricular anterior wall specimens were collected，and Real-time PCR and Western blot were used to detect the expression level of HIF-1αmRNA and protein in myocardium.Results⑴The protein expression of HIF-1αin D+MI/R group was significantly higher than that of MI/R group at the same time point after-reperfusion，the protein expression of HIF-1αin D+MI/R group was increased at first and then decreased，and reached the peak in the I/R 3 h（P＜0.05）.⑵There were no significant differences among themRNA expression of HIF-1αin any two groups and at four time points after I/R in each group（P＞0.05）.ConclusionDMOG pretreatment could stabilize the protein expression of HIF-1αafter MI/R，and it reach the peak at 3 h after I/R，but has no obvious influence on themRNA expression of HIF-1α，indicate that the effect occursmainly in the protein synthesis level rather than gene transcription level.

Hypoxia inducible factor-1α； DMOG； Myocardial Ischemic/reperfusion injury

山西省自然科学基金（项目编号：2016011115、2012011040-7）；

030001 山西省太原市，山西医科大学基础医学院生理学系，细胞生理学山西省重点实验室

贺忠梅，E-mail：hezmei@126.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2017．01．023

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2017）01-0082-04

2016-07-09）

山西医科大学科技创新基金（项目编号：01201501）