朱 颖，林 琦，游丽斌，黄枝妙，陈敏红，姚 栩，张拥军,2，欧剑鸣，翁育伟,2

一起腺病毒引起的聚集性呼吸道感染的实验室调查

朱 颖1，林 琦1，游丽斌1，黄枝妙1，陈敏红3，姚 栩3，张拥军1,2，欧剑鸣1，翁育伟1,2

目的对一起幼儿园聚集性发热事件开展病原学调查，为疫情处置提供依据。方法采集部分患者呼吸道样品，应用real-time RT-PCR法筛查，腺病毒核酸阳性样品接种HEp-2 细胞系，PCR扩增部分腺病毒Hexon高变区基因片段并测序，确定病毒型别并进行变异分析。结果从10份咽拭子标本中检测到7份腺病毒核酸阳性。经分离培养得到7株人腺病毒毒株。系统进化分析确定均为人腺病毒7型。推导的氨基酸序列分析显示，与近年来国内外流行株相比，分离株的Hexon蛋白高变区无氨基酸位点突变。结论结合病例临床表现以及流行病学调查结果，此事件证实系人腺病毒7型引起的急性呼吸道感染聚集性事件。

人腺病毒； 病毒分离；序列分析

腺病毒是一类无包膜、直径约90 nm的二十面体球形病毒，病毒基因组为双链DNA，约26～45 kb。腺病毒可感染多种脊椎动物，其中，可感染人的腺病毒(Human Adenovirus，HAdV)迄今为止已发现约57种。根据血清试验、血凝试验、对啮齿动物类致癌性、培养原代细胞的转化及序列分析差异等，HAdV可分为A-G 7个种(Species)。HAdV主要壳蛋白六邻体蛋白(Hexon)包含了重要的抗原位点，根据其差异，每个种内的病毒可进一步分为不同的型别[1]，例如A种病毒包含HAdV-12、-18等型别，B种病毒包含HAdV-3、-7、-11等型别。不同种HAdV可识别不同组织细胞受体，具有不同的组织嗜性，可引起呼吸道、肠道、眼睛、膀胱以及肝脏的感染，表现为急性发热呼吸系统疾病、胃肠炎、肺炎、肾脏感染等症状，并可引起流行传播[2]。人呼吸道感染HAdV主要包括B、C、E等种，严重的下呼吸道疾病通常伴有HAdV-3、-7、-21、-4感染；而HAdV-1、-2、-5、-3、-7常引起轻微的上呼吸道感染。在儿童呼吸系统疾病中约有5%～10%由HAdV引起，HAdV也常在疗养院和军队中引起暴发流行[1,3]。

2016年10月，福建省福州市某幼儿园发生一起聚集性发热事件。通过对患者标本进行病毒核酸筛查，检出7份呼吸道腺病毒阳性。随后进行病原体分离并测定病毒Hexon蛋白高变区，确定该病毒为HAdV-7型，同时，与近年来国内外流行的同型病毒比较，没有发现氨基酸变异。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本 采集福建省福州市某幼儿园发热病例咽拭子10份、血清标本7份，低温运送至实验室。

1.2 主要试剂 甲、乙型流感病毒核酸测定试剂盒(荧光RT-PCR法)、人副流感病毒1-4型核酸测定试剂盒(荧光RT-PCR法)、人冠状病毒核酸测定试剂盒(荧光RT-PCR法，包括HKU1、229E、NL63、OC43型)、肠道病毒通用型核酸测定试剂盒(荧光RT-PCR法)、呼吸道腺病毒核酸测定试剂盒(荧光PCR法)等均购自上海之江生物科技有限公司；病毒RNA/DNA提取试剂盒购自苏州天隆生物科技有限公司；PrimeSTAR○RHS DNA Polymerase购自TaKaRa公司；HEp-2 (CCL-23)细胞来源自美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)；MEM培养基购自日水制药株式会社。

1.3 标本核酸提取及检测 取200 μL咽拭子或血清标本，按照试剂盒说明书进行核酸提取。采用荧光定量RT-PCR或PCR法进行筛查，按试剂说明，配置反应体系，对标本进行流感、冠状病毒、副流感病毒、肠道病毒和呼吸道腺病毒核酸检测。检测呼吸道腺病毒反应条件为37 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min，再按93 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环，单点荧光检测在60 ℃，反应体系40 μL。

1.4 病毒分离 向阳性咽拭子标本加入双抗溶液至终浓度为：青霉素G 100 U/mL；硫酸链霉素100 μg/mL，混匀后置4 ℃作用2 h后进行接种。待HEp-2细胞生长到80%左右，取200 μL咽拭子标本接种，37 ℃、5% CO2培养7 d，盲传1代，出现典型致细胞病变效应(Cytopathic effect，CPE)后，收集二代分离液进行进一步鉴定。

1.5 型别鉴定及进化树构建 对分离到的毒株，扩增Hexon基因的高变区(Hypervariable region 1-7，HVR1-7)[3-4]，上游引物为P-061(5′-GACAGGATGCTTCGGAGTACC-3′)，下游引物为BR(5′-CTTGTATGTGGAAAGGCAC-3′)。PCR反应条件为95 ℃ 5 min，98 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min，36个循环，72 ℃ 10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，纯化、回收后，由铂尚生物技术(上海)有限公司进行序列测定。序列数据在GenBank数据库进行BLAST对比，采用MEGA6软件、Neighbor-Joining方法绘制系统进化树。

1.6 抗原性分析 测序获得核酸序列采用EditSeq软件翻译成氨基酸序列，推导的氨基酸序列采用DNAman进行变异氨基酸分析。

2 结 果

2.1 疫情概况 2016年10月8日至10月30日，该幼儿园累计发现病例42例，(其中7例为本实验确诊)，男性24例，女性18例。人群罹患率为10.69%(42/393)。所有病例症状主要有发热(腋温大于等于38.0 ℃)，伴咳嗽、咽痛症状，无淋巴结肿大、腹泻呕吐、皮疹、神经系统功能异常等，仅1例出现热性惊厥。所有病例中儿童41例，成人1例，共有22名该园儿童住院治疗。除上述病例外，另有3例该幼儿园相关人员发病，两人为患儿家属(成人1例，儿童1例)，另一名为曾经去过该幼儿园的儿童，其中2名儿童患者住院治疗。经过治疗，所有病例均恢复健康，住院病例均出院，10月30日以后无新发病例。

2.2 实验室筛查 采集咽拭子10份、血清标本7份提取总核酸，进行流感病毒等(含有流感病毒检测、副流感病毒检测、冠状病毒检测、肠道病毒检测和呼吸道腺病毒检测)呼吸道病毒核酸检测，其中7份咽拭子标本为呼吸道腺病毒核酸阳性，阳性率为70%，血清标本未检出。其他标本检测项目均为阴性。2.3 病毒培养和序列测定 对7份腺病毒核酸阳性咽拭子标本进行病毒分离培养，盲传一代。第1代分离上清接种HEp-2细胞后72 h，细胞开始出现形态改变，培养第5 d，大部分病变的细胞脱落，聚成葡萄状，7份阳性标本接种后均出现明显的CPE(图1 B)。毒株命名为HAdV-7/FJFZ001/CHN/2016 至HAdV-7/FJFZ007/CHN/2016。病毒鉴定采用引物P-061、BR进行PCR扩增，7份分离液核酸均扩增出1 500 bp条带，与预期片段大小相符(图2)。

Normal HEp-2 cells (A) and the cells infected with HAdV (B) on five days post-inoculation.图1 人腺病毒感染HEp-2细胞的致细胞病变效应(200×)Fig.1 Cytopathic effect induced by HAdV in HEp-2 cell-lines. (200×)

M: DNA molecular weight marker (bp); Lane1-7: PCR product from viral isolates of HAdV-7/FJFZ001/CHN/2016 ～HAdV-7/FJFZ007/CHN/2016图2 人腺病毒Hexon高变区1-7基因片段的扩增Fig.2 PCR amplification of hypervariable region 1-7 of Hexon protein of human adenovirus

图3 根据Hexon高变区基因片段构建的分子进化树Fig.3 Phylogenetic tree based on Hexon HVR sequence of HAdV

2.4 序列测定以及种系进化分析 扩增产物经序列测定、BLAST比对以及种系进化分析，本实验分离所得的毒株为人腺病毒7型(HAdV-7，图3)，该型病毒属于B种腺病毒。从种系发生树看(图3)，本次病例分离的HAdV-7(HAdV-7/FJFZ001/CHN/2016 至HAdV-7/FJFZ007/CHN/2016)与疫苗株(登录号：AY495969，AY594256)、美国、俄罗斯等地，以及近年来其他省份发现的HAdV-7株高度相似，同源性可达99%，同属于一个进化分枝，不同地区、不同年份的7型株未见明显差异。但与50年代分离得的HAdV-7原型株Gomen株亲缘关系较远。2.5 氨基酸序列分析 分析病毒Hexon蛋白氨基酸推导序列，本次分离的病毒株HAdV-7(HAdV-7/FJFZ001/CHN/2016 至HAdV-7/FJFZ007/CHN/2016)与近年来其他国内外毒株及疫苗株高度相似，7个高变区(HVR1-7)氨基酸序列保持一致(图4)，说明并未发生抗原漂移。而与HAdV-7原型株Gomen的差异，主要发生在HVR1和HVR7区，这2个高变区的氨基酸突变位点较多，比如HVR1的A138T、E141D、T145N、T146A、N149Y以及142-144的RAV缺失，HVR7的A411G、K412N、T413K、S419P、K420R、N422T、G423A、D428T、N429K、K432T、S433A(氨基酸位点以Gomen株为准)。

图4 Hexon蛋白高变区HVR1-7推导氨基酸序列分析Fig.4 Comparison of deduced HVR 1-7 amino acid sequence of Hexon

3 讨 论

从病例的临床表现以及实验室检测结果，可以确定本次疫情系一起由HAdV-7引起急性呼吸道感染聚集性事件。事件发生的原因可能是由于该幼儿园举行室内大型活动，造成人员交叉接触，且事后未及时发现、隔离患儿导致疫情蔓延。

腺病毒是引起人急性呼吸道感染的重要病原体之一，成人和儿童均能感染此病毒，国内外均有报道[5]。从全球范围看，人群中流行的HAdV有多种型别，常见B种3型和7型为优势型别[6-7]。部分省份的病毒分子进化研究发现，国内主要以B或C种为优势种，或B、C种交替成为优势种，有的地区有由单一或少量优势型别演变成多种型别共同散发流行的趋势[8-9]，总体流行趋势与国际相似。HAdV-7导致了世界范围约20%的腺病毒感染，尤其对于7岁以下儿童和健康状况不良的人群常引发较严重的病症，常伴有残留肺损伤和致命的结果，严重的会引起婴幼儿死亡[10]，应予以重视。

腺病毒Hexon蛋白包含了重要的抗原位点，抗原表位ε决定簇由2个高变环Loop1和Loop2组成，Loop1含有6个高变区(HVR1-6)，Loop2含有1个高变区(HVR7)。Loop2的序列可用于病毒精确分型，Loop1的序列可用于定义新的分离株[1,3,11]。通过比对Hexon HVR1-7基因序列发现，近年来的流行的HAdV-7与50年代发现的原型株Gomen已经发生了较大的遗传变异，HAdV-7株已发生了基因水平转移[12]。本次聚集性发热事件分离株与国内外近年流行株同源性较高，表明近几年来HAdV-7的遗传相对稳定，与Purkayastha等[13]研究结果相符。HAdV-7在世界范围内循环具有复杂的传播链，例如，国内循环的流行株0901HZ/ShX/CHN/2009(登录号：JF800905)和human/CHN/DG01/2011/7[P7H7F7](登录号：KC440171)与美国、新加坡、蒙古等地的流行暴发相关，但具体传播途径不明确[6,14-15]。本次分离株与上述分离株在亲缘关系上相近，提示近年来全球流行的HAdV-7流行株相对稳定，这有利于疫苗发挥免疫保护作用。

抗原分析结果显示，近年来HAdV-7的流行株相对稳定，但与原型株Gomen差异较大，特别在Hexon蛋白Loop1的HVR1和Loop2的HVR7区域，HVR2则高度保守，没有氨基酸突变位点。Tian等[16]研究表明，HVR2和5在所有的HAdV7株中都保守，可能含有HAdV-7型特异的抗原表位。而HVR1，4和7在同一种亚型中保守，可能含有亚型的抗原表位。这几个位点在不同的亚型中有较大的改变，可能与抗原漂移有关。本次分离株与近年来各地流行株及疫苗株的Hexon蛋白氨基酸序列保持一致，表明未出现抗原漂移，且目前暂时没有证据表明不同的HAdV-7变异株在临床表现、毒力和传播能力上有显著的差别[17]，提示在人群中如果接种疫苗可达到保护效果。

由于腺病毒疫苗普及率不高，人群尚未形成免疫保护，若出现变异株或者毒力更高的型别则可能造成暴发流行[9]。福建省地处东南沿海，与广东、浙江等省份相邻，旅游贸易频繁，城市扩张较快，人口密集，应对福建地区HAdV进行监测，把握分子进化规律，为呼吸道腺病毒的早期预防和治疗提供理论依据。

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Weng Yu-wei, Email: wengywfjcdc@aliyun.com

Laboratoryinvestigationofaclusteredrespiratorytractinfectionwithhumanadenovirus

ZHU Ying1,LIN Qi1,YOU Li-bin1,HUANG Zhi-miao1,CHEN Min-hong3, YAO Xu3,ZHANG Yong-jun1,2,OU Jian-ming1,WENG Yu-wei1,2

(1.FujianCenterforDiseaseControlandPrevention,Fuzhou350001,China; 2.FujianProvincialKeyLaboratoryofZoonosisResearch,Fuzhou350001,China; 3.FuzhouCenterforDiseaseControlandPrevention,Fuzhou350001,China)

In order to investigate the pathogens associated with a clustered event of fever occurred in a kindergarten in Fuzhou, Fujian Province, samples were collected from pediatric cases in the kindergarten and screened for various possible viral agents by real-time PCR. Of 10 respiratory specimens, 7 were positive of human adenovirus (HAdV). The positive samples were inoculated into HEp-2 cell-lines for viral isolation. The PCR products of the hypervariable regions ofHexongene were sequenced, followed by BLAST searches for viral type identification. In comparison with the strains prevalent in domestic or abroad in recent years, the deduced amino acid sequences showed no amino acid mutation in the hypervariable regions ofHexon. Combined with clinical manifestation and field epidemiological data, human adenovirus type 7 could be confirmed as the pathogen linked to the clustered event.

human adenovirus; viral isolation; sequence analysis

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.08.004

国家高技术研究计划(No.2011AA02A114)

翁育伟，Email: wengywfjcdc@aliyun.com

1.福建省疾病预防控制中心，福州 350001； 2.福建省人兽共患病重点实验室，福州 350001； 3.福州市疾病预防控制中心，福州 350001

Support by the Chinese National High Technology Research and Development Program (No. 2011AA02A114)

R373.1

：A

：1002-2694(2017)08-0685-05

2017-02-21编辑：刘岱伟