丁 慧，胡龙华，钟桥石，杭亚平，刘衍伶，俞 凤，陈艳慧，胡晓彦，张黎明，章白苓，张 楠，王小中

携带wcaG毒力基因ST19 产酸克雷伯菌致白血病患者死亡的分析

丁 慧，胡龙华，钟桥石，杭亚平，刘衍伶，俞 凤，陈艳慧，胡晓彦，张黎明，章白苓，张 楠，王小中

目的了解1例高黏液表型(HMV)产酸克雷伯菌致白血病患者的死亡原因。方法采用Vitek 2 Compact全自动微生物仪进行菌株鉴定及药敏试验，黏液丝试验检测HMV表型，PCR方法及基因测序检测主要的高毒力荚膜血清型基因(K1、K2、K5、K20、K54、K57)和毒力基因(rmpA、wcaG、allS、kfu、aerobactin、mrkD、fimH、uge、wabG、cf29a)，多位点序列分析(MLST)对该菌株进行分子分型。结果白血病患者血液及肺组织分离株均为产酸克雷伯菌，MLST分型为同一型ST19，该菌株对所测药物均敏感，具有高黏液表型，只检测到wcaG毒力基因，其他毒力基因和所测荚膜血清型基因均阴性。结论携带wcaG毒力基因是ST19产酸克雷伯菌致白血病患者死亡的主要原因，应引起临床关注。

产酸克雷伯菌；毒力；白血病；黏液；多位点序列分析

克雷伯菌属是临床常见条件致病菌，主要包括肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌，既能引起医院感染，也可造成社区感染，也是医院感染部门的重点监控菌株，主要引起免疫功能低下患者的下呼吸道、泌尿系统、腹腔及血流等感染。过往临床关注最多的是多重耐药克雷伯菌的感染，尤其是耐碳青霉烯类抗菌药物的克雷伯菌感染[1]。但近几年，一种常可危及患者生命的高毒力肺炎克雷伯菌的感染而引起广泛关注，北美、欧洲等多地均有报道，尤其令人惊奇的是，其感染主要发生于亚裔患者，临床主要表现为肝脓肿、严重肺炎、眼肉炎及颅内感染[2]。此类菌株的特点是毒力强，可引起免疫功能正常者严重感染，但耐药性不强，通常对临床常用抗菌药物均敏感，临床医生在抗感染时易忽视。最近我们分离到一株高毒力产酸克雷伯菌，现将结果报道如下，希望能引起临床医生及临床微生物工作者的关注。

1 材料与方法

1.1 临床资料 患者，男，27岁，工人。因“发现白细胞低15月”于2015年9月9日入住南昌大学第二附属医院血液内科，经骨髓穿刺细胞学等相关检查，确诊为急性淋巴细胞白血病(ALL)，于9月16日行VDLP方案化疗同时给予阿莫西林/克拉维酸预防感染。9月27日患者进入化疗粒细胞缺乏阶段并且发热，体温最高至39℃，给予哌拉西林/他唑巴坦钠、阿米卡星联合氟康唑抗感染治疗，患者体温间断波动于38 ℃左右。10月26日患者突发高热达39 ℃，咳嗽咳黄色脓痰，伴右侧胸痛。查体：咽红，扁桃体可见2个小溃疡，颈软，双肺呼吸音粗，右肺闻及较多湿罗音，心律齐，腹软，肝脾肋下未触及，双下肢病理征阴性。血常规：白细胞27.65×109/L，中性粒细胞90.7%,淋巴细胞4.3%。血沉129 mm/h，降钙素原0.53 ng/mL。胸部CT：右肺上叶见一含气空洞，内壁不规整，右肺见大片状实变影及磨玻璃影，边界不清。结核杆菌T细胞检测阴性，真菌D及GM实验均阴性。血培养示：产酸克雷伯杆菌。患者感染控制不佳，将抗菌药物调整为头孢哌酮钠舒巴坦钠、替考拉宁联合米卡芬净。为进一步明确病因，11月3日行经皮肺穿刺活检术，取3块病理组织行活检及细菌培养。11月5日17:45分患者胸闷、气喘，转至呼吸科ICU。19:33分患者临床死亡。11月6日组织黏膜细菌培养示：产酸克雷伯菌。

1.2 主要仪器和试剂 Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定系统和药敏系统(法国梅里埃生物公司)，MG48G PCR仪(杭州朗基科学有限公司)，DYC-6C电泳仪和凝胶成像仪(北京六一公司)。PCR试剂购于通用生物有限公司，相关扩增引物由上海生工生物技术有限公司合成。

1.3 细菌培养鉴定与药敏实验 患者寒战时由病房护士以无菌技术抽取双侧肘静脉血液各10 mL注入BACT/ALERT 3D 需氧中和抗生素培养瓶中，送至微生物室并及时放入血培养仪中。待阳性报警后再抽取瓶中标本接种血琼脂平板、巧克力琼脂平板、中国蓝琼脂平板以及涂片革兰染色，平板放置5% CO2环境孵育18～24 h。活检粘膜组织研磨成组织碎片，接种环挑取适量碎片接种以上3种平板，挑取纯培养物采用法国生物梅里埃公司 Vitek 2 Compact 全自动细菌鉴定仪进行菌株鉴定及药敏试验，结果按照美国临床和实验室标准协会(CLSI 2015年版)推荐标准进行判读。标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922 和肺炎克雷伯菌ATCC700603。

1.4 高黏液性(hypermucoviscosity,HM)表型检测 将产酸克雷伯菌接种于哥伦比亚血琼脂平板上 35 ℃培养过夜，次日用接种环轻拉菌落，测量 “拉丝”长度>5 mm 判为是 “拉丝”阳性，即高黏液菌株; ≤5 mm判为是 “拉丝”阴性。实验需重复2次结果才可确认[3]。

1.5 PCR检测毒力基因 PCR扩增K1、K2、K5、K20、K54、K57、rmpA、wcaG、allS、kfuBC、aerobactin、fimH、uge、wabG、cf29a毒力基因。上、下游引物序列见表 1。反应体系参见文献[4]。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳进行分析。阳性产物送生工生物工程 (上海) 股份有限公司测序，测序结果上传 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/网站比对分析。

1.6 多位点序列分型( MLST) PCR扩增rpoB、phoE、mdh、infB、pgi、tonB和gapA7 个产酸克雷伯菌的管家基因，引物序列和反应体系参照文献[5]。扩增阳性产物送生工生物工程 (上海) 股份有限公司测序，测序结果上传 http://pubmlst.org/网站进行比对确定 MLST 类型。

2 结 果

2.1 细菌培养鉴定与药敏结果 血培养及肺组织培养的菌株经鉴定均为产酸克雷伯菌，且药敏结果一致。ESBLS阴性，对哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、替加环素、头孢哌酮、头孢吡肟、头孢曲松、头孢西丁、阿米卡星、左氧氟沙星、庆大霉素、磺胺甲基口噁唑均敏感。

2.2 HM结果 “拉丝”长度均>5 mm, “拉丝”实验阳性，表明两株产酸克雷伯菌具有高黏液表型属于高黏液菌株。

2.3 毒力基因及分子分型结果 PCR基因扩增并序列分析未检测到荚膜血清基因(K1、K2、K5、K20、K54、K57)和rmpA, 检测到wcaG基因。MLST分型均为ST19。

3 讨 论

男性患者，27岁，因反复外周血白细胞数低，于2015年9月9日入住血液内科，经骨髓穿刺细胞学等相关检查，确诊为急性淋巴细胞白血病(ALL)，于9月16日行VDLP方案化疗，考虑到患者免疫功能低下，同时给予阿莫西林/克拉维酸预防感染。9月27日22时，患者在无咳嗽咳痰、畏寒寒战，且无其他明显诱因情况下出现发热，体温最高至39 ℃，急查血常规及血培养，血常规：白细胞 0.22×109/L，中性粒细胞4.6%，淋巴细胞90.9%；血培养阴性。结果表明，患者已进入粒细胞缺乏阶段，且有发热表现，需加强抗感染治疗，将抗感染药物调整为哌拉西林/他唑巴坦钠、阿米卡星联合氟康唑，在医护人员的精心呵护和其他支持治疗的情况下，患者体温间断波动于38 ℃左右。10月26日患者再次出现高热，体温高达40 ℃，扁桃体可见2个小溃疡，伴咳嗽咳黄色脓痰，双肺呼吸音粗，右肺闻及较多湿罗音，胸部CT右肺上叶见一含气空洞，内壁不规整，右肺见大片状实变影及磨玻璃影，边界不清；血常规白细胞27.65×109/L，中性粒细胞90.7%, 淋巴细胞4.3%，血培养及穿刺肺组织培养均为产酸克雷伯菌，菌株对所测药物均敏感，且经MLST证实为同一株菌，依据病原体药物敏感试验结果及患者临床表现，将抗菌药物调整为头孢哌酮钠舒巴坦钠、替考拉宁联合米卡芬净，虽然菌株对临床常用抗菌药物均高度敏感，临床也进行了积极的抗感染治疗，但令人遗憾的事还是发生了，患者于11月5日出现室颤，经抢救无效而死亡。有文献曾报道白血病患者由于糖皮质激素和免疫抑制剂的使用、各种侵入性操作、住院时间长等因素，易发生医院感染，感染好发于呼吸道，以革兰阴性杆菌为主[6]。

产酸克雷伯菌是克雷伯菌属中仅次于肺炎克雷伯菌的临床常见病原菌，为条件致病菌，感染致患者死亡并不常见，况且该患者血液及肺穿刺组织分离株对临床常用抗菌药物均敏感，临床依据药敏试验结果选用了强有力的抗菌药物，但还是未能控制感染而致患者死亡。有研究报道，高毒力克雷伯菌感染难控制，易致患者死亡，黏液表型是鉴定分离株是否为高毒力的重要条件[7]。本研究结果表明，血液及肺组织分离株均为MH表型，具有MH表型的菌株更易引起侵袭性感染，若为血流感染，则更易随血流播散至全身其他各重要器官，形成多发性脓肿及多器官衰竭，如肝脓肿、脓胸、脑膜炎及眼内炎等，严重危及患者的生命。Lee C H等曾报道具有高黏液表型的克雷伯菌在引起的侵袭性感染中，能更有效抵抗补体和吞噬细胞杀伤作用、降低对血清杀伤作用的敏感性，并在动物实验中证实有更强的毒力[8]。

令人奇怪的是，此次分离获得的高黏液产酸克雷伯菌6种常见的荚膜血清型基因均阴性，是否还有其他荚膜血清基因介导，还有待进一步研究。为了进一步了解其毒力，在此次研究中我们还同时检测了产酸克雷伯菌铁摄取系统相关的毒力基因(allS、kfu、aerobactin)、粘附因子(mrkD)、毒素因子相关基(fimH、uge、wabG、cf29a、rmpA、wcaG)共10种密切相关的毒力基因，只检测到wcaG.。wcaG.主要功能为编码细菌荚膜的海藻糖, 使细菌躲避巨噬细胞的吞噬作用，同时编码抗炎因子激活蛋白，并且与细菌毒素的产生有密切关系[9]。有趣的是，本研究菌株毒力强，短时间内致感染患者死亡，但其对临床常用抗菌药物均敏感，且为非产ESBLs菌。可能是高毒力菌株携带毒力基因的质粒较大，同时获取耐药质粒较困难，或是毒力基因与耐药基因具有不相容性，获得毒力基因同时丢失耐药基因，从而产生黏液表型和对抗菌药物敏感的特性。另有报道，非产ESBL株比产 ESBL 株耐药性弱，但毒力更强，能更有效抵抗血清杀伤作用[10]。

此次分离获得的产酸克雷伯菌为ST19，属于发育树分类中的A群，其毒素与抗生素相关性出血性结肠炎发生发展密不可分[11]。产酸克雷伯菌释放的毒素可引起抗生素相关性出血性结肠炎，严重者可引起败血症休克或死亡[12]。

综上所述，对克雷伯菌属引起的血流等严重感染，临床除积极抗感染治疗外，还应密切关注患者病情进展；临床微生物工作者不仅要对菌株进行药物敏感试验，还应观察菌落的黏液表型，并进行黏液表型检测，黏液表型检测方法操作简单，结果易判读，普通临床微生物实验均能开展，必要时还需对菌株进行相关毒力基因检测，并将结果及时与临床沟通，警惕高毒力克雷伯菌的感染。

表1 基因引物序列、产物大小及退火温度Tab.1 Primers product size and annealing temperature used in this study

续表

[1] Yang M, Wang P, Xu XQ, et al. Resistance genes distribution and molecular typing characteristics of carbapenem-resistentKlebsiellapneumoniae[J]. Chin J Zoonoses, 2016, 32(12):1039-1043.

杨梦,王鹏, 徐晓倩,等. 碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯菌耐药基因分布和分子分型[J].中国人兽共患病学报,2016, 32(12):1039-1043.

[2] Ling DD,Shen DX. Recent research and prospect on hypervirulentKlebsiellapneumoniae[J]. Chin J Infect Dis, 2014, 32(10): 638-640.

李东冬,沈定霞. 高毒力肺炎克雷伯菌的研究现状与展望[J]. 中华传染病杂志. 2014, 32(10): 638-640.

[3] Wiskur BJ, Hunt JJ, Callegan MC. Hypermucoviscosity as a virulence factor in experimentalKlebsiellapneumoniaeendophthalmitis[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2008, 49(11): 4931-4938. DOI: 10.1167/iovs.08-2276

[4] Ishihara Y, Yagi T, Mochizuki M, et al. Capsular types, virulence factors and DNA types ofKlebsiellaoxytocastrains isolated from blood and bile [J]. Kansenshogaku Zasshi, 2012, 86(2): 121-126. (in Japanese).

[5] Zollner-Schwetz I, Herzog K A, Feierl G, et al. The toxin-producing pathobiontKlebsiellaoxytocais not associated with flares of inflammatory bowel diseases[J]. Dig Dis Sci. 2015, 60(11): 3393-3398. DOI: 10.1007/s10620-015-3765-y

[6] Du XZ,Zhong QY,Yang H, et al. Acute leukemia amalgamative infection:clinical analysia and preventive countermeasures[J]. Chin J Nosocomiol, 2011, 21(7): 1337-1338.

杜香洲,钟巧玉,杨红,等.急性白血病合并感染临床分析及防治对策[J]. 中华医院感染学杂志. 2011, 21(7): 1337-1338.

[7] Shen DX, Wang J, Li DD.Klebsiellapneumoniaeliver abscesses[J]. Lancet Infect Dis, 2013, 13(5): 390-391. DOI: 10.1016/S1473-3099(13)70068-9

[8] Lee C, Liu J, Su L, et al. Hypermucoviscosity associated withKlebsiellapneumoniae-mediated invasive syndrome: a prospective cross-sectional study in Taiwan[J]. Intl Infect Dis, 2010, 14(8): E688-E692. DOI:10.1016//j.ijid. 2010.01.007

[9] Yu VL, Hansen DS, Ko WC, et al. Virulence characteristics ofKlebsiellaand clinical manifestations ofK-pneumoniaebloodstream infections[J]. Emerg Infect Dis, 2007, 13(7): 986-993. DOI: 10.3201/eid1307.070187

[10] Lin H, Huang Y, Yeh K, et al. Regulator of the mucoid phenotype A gene increases the virulent ability of extended-spectrum beta-lactamase-producing serotype non-K1/K2Klebsiellapneumonia[J]. Microbl Immunol Infect, 2016, 49(4): 494-501. DOI: 10.1016/j.jmii.2014.08.023

[11] Herzog KAT, Schneditz G, Leitner E, et al. Genotypes ofKlebsiellaoxytocaisolates from patients with nosocomial pneumonia are distinct from those of isolates from patients with antibiotic-associated hemorrhagic colitis[J]．Clini Microbiol, 2014, 52(5): 1607-1616. DOI: 10.1128/JCM.03373-13

[12] Al-Anazi KA, Al-Jasser AM, Al-Zahrani H A, et al.Klebsiellaoxytocabacteremia causing septic shock in recipients of hematopoietic stem cell transplant: Two case reports[J]．Cases J，2008, 1(1): 160. DOI: 10.1186/1757-1626-1-160

HU Long-hua，Email:longhuahu@163.com

DeathcausedbyST19KlebsiellaoxytocawithwcaGvirulencegeneinleukemicpatient

DING Hui， HU Long-hua, ZHONG Qiao-shi, HANG Ya-ping, LIU Yan-ling, YU Feng, CHEN Yan-hui, HU Xiao-yan, ZHANG Li-ming, ZHANG Bai-ling, ZHANG Nan, WANG Xiao-zhong

(ClinicalLaboratory,theSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,JiangxiProvinceKeyLaboratoryofLaboratoryMedincineNanchang330006,China)

We investigated the cause of a leukemia patient induced by infect in a strain ofKlebsiellaoxytocawith hypermucoviscosity (HMV) phenotype. Identification and drug susceptibility of the isolate were carried out with VITEK-2 compact system. HMV phenotype was detected by string-test. The major high virulence capsular serotypes (K1, K2, K5, K20, K54 and K57) and virulence factors (rmpA,wcaG,allS,kfu,aerobactin,fimH,uge,wabGandcf29a) were detected by polymerase chain reaction and DNA sequencing. Molecular typing was performed by multilocus sequence typing (MLST). Results showed that the isolates of blood and lung tissue wereKlebsiellaoxytocabelonged to ST 19, which were sensitive to the antibiotics used in test, expressing the HMV phenotype. The virulence genewcaGwas found, while other virulence genes and the major high virulence capsular serotypes were negative. It indicates that ST19Klebsiellaoxytocawith wcaG virulence gene is the main reason causing leukemic patient death.

Klebsiellaoxytoca; virulence;leukemic; mucous; multilocus sequence typing (MLST)

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.08.018

胡龙华, Email:longhuahu@163.com

南昌大学第二附属医院检验科，江西省医学检验重点实验室，南昌 330006

R378

：A

：1002-2694(2017)08-0753-04

2017-02-14编辑：刘岱伟