桑叶茯砖茶“金花”菌的分离鉴定

2017-09-03邵元元肖建中李飞鸣李一平邹湘月龙唐忠黄仁志颜新培

中国蚕业 2017年3期

关键词：砖茶金花桑叶

邵元元肖建中李飞鸣李一平张俊邹湘月龙唐忠黄仁志颜新培

(湖南省蚕桑科学研究所，湖南长沙 410127)

桑叶茯砖茶“金花”菌的分离鉴定

邵元元肖建中李飞鸣李一平张俊邹湘月龙唐忠黄仁志颜新培

(湖南省蚕桑科学研究所，湖南长沙 410127)

从桑叶茯砖茶中分离出“金花”菌，经过继代纯化，以长势较好的桑叶茯砖茶“金花”菌作为供试菌株，用传统微生物形态学鉴定方法，观察其形态特征与生长特性等；运用光学显微镜观察菌株的有性型和无性型形态，并在扫描电镜下观察菌株的子囊孢子、分生孢子等，同时结合ITS测序，在分子水平上对分离菌株进行鉴定。结果表明：桑叶茯砖茶中分离的“金花”菌，菌株的形态特征和生长特性、光学显微镜和扫描电镜显微特征与冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)相似，通过ITS序列分析，确认该桑叶茯砖茶“金花”菌株为冠突散囊菌。试验鉴定为借鉴传统茯砖茶的相关研究成果开展桑叶茯砖茶品质形成机理、功能性作用及其加工工艺比较研究奠定了基础。

桑叶茯砖茶；“金花”菌；冠突散囊菌；分离培养；形态学鉴定

茯砖茶是以三级或四级黑毛茶为原料，经过筛分、拼配、汽蒸、渥堆、筑制、发花、干燥和成品包装等工艺制成的黑茶产品[1]。茯砖茶内生长着大量特征性优势益生菌——冠突散囊菌，冠突散囊菌的闭囊壳色泽金黄，俗称“金花”。“金花”菌利用茶砖内部的营养物质进行代谢转化，抑制其它微生物的生长繁殖[2]，产生各种胞外酶[3-5]和生物活性物质[6-7]，赋予了茯砖茶独特的品质和较强的降脂、降压以及调节糖类代谢等功效[8]，并对人体没有毒副作用[9]，因此“金花”的数量和质量己成为判断茯砖茶品质优劣的重要标志[10]。

茯砖茶一直以来以茶科茶属的茶树叶为原料，2013年湖南省蚕桑科学研究所桑叶黑茶创新团队，首次以桑叶毛茶为原料，接种培养从安化茯砖茶中分离得到的“金花”菌株制作茯砖茶获得成功。李飞鸣等[11]和邵元元等[12]进行了以桑科桑属的桑叶和黑毛茶制作桑叶茯砖茶和复配桑叶茯砖茶的工艺研究及其他有关桑叶茯砖茶的研究。本文釆用微生物经典鉴定法[13-14]，对桑叶茯砖茶“金花”菌株的形态特征进行了光学显微镜与扫描电镜分析研究，并在微生物分类学上对桑叶茯砖茶“金花”菌进行了鉴定，期望为桑叶茯砖茶的发花工艺、品质形成机理与功能性研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试桑叶茯砖茶 2014年安化云天阁茶叶有限公司生产的桑叶茯砖茶。

1.1.2 供试药剂硝酸钠(分析纯)、硫酸亚铁(分析纯)，均为台山市化工有限公司产品；磷酸氢二钾(分析纯)、氯化钾(分析纯)、蔗糖(分析纯)、石炭酸(分析纯)，均为国药集团化学试剂有限公司产品；七水硫酸镁(分析纯)，西陇化工股份有限公司产品；乳酸(分析纯)，无锡市亚泰联合化工有限公司产品；琼脂，Biosharp公司产品；DNA提取试剂盒，天根生化科技有限公司产品；PCR产物试剂盒、扩增引物ITS1、扩增引物ITS4，均为生工生物工程有限公司产品；棉兰染色剂，罗基生物技术有限公司产品。

1.1.3 主要仪器设备 LRH-150培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司产品；AL204型电子天平，梅特勒-托利多(中国)仪器有限公司产品；YXQ-LS-50SII型立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司产品；JSM-6380LV型电子显微镜，日立电子株式会社产品；SS3型多功能液晶数码显微镜，深圳市爱科学数码科技有限公司产品；电子万用炉，郑州中天仪器有限公司产品；XC-750型中药粉碎机，深圳雷粤机械设备有限公司产品；PCR反应扩增仪，加拿大BBI公司产品；BCD-208K/A型海尔冰箱，海尔公司产品；DK-8D型电热恒温水槽，上海森信实验仪器有限公司产品；DYY-8型稳压稳流电泳仪，上海琪特分析仪器有限公司产品；凝胶成像系统，Gene Genius公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基制备 (1)普通察氏固体培养基的制备：硝酸钠3 g、磷酸氢二钾1 g、七水硫酸镁0.5 g、氯化钾0.5 g、硫酸亚铁0.01 g、蔗糖30 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL。(2)20%高糖察氏固体培养基的制备：硝酸钠3 g、磷酸氢二钾1 g、七水硫酸镁0.5 g、氯化钾0.5 g、硫酸亚铁0.01 g、蔗糖200 g、琼脂20 g、蒸馏水 1 000 mL。将琼脂煮沸搅拌均匀，其余的药品用蒸馏水溶解，再将2者混合定容，封口后高压灭菌备用。

1.2.2 培养基平板和斜面的浇制 (1)固体培养基平板的浇制。分别将配制好的普通察氏固体培养基、20%高糖察氏固体培养基和玻璃培养皿在121 ℃条件下灭菌20 min，灭菌完毕后培养基在超净工作台上冷却至50 ℃，培养皿在烘箱内70 ℃烘干，准备完毕后开始浇制平板，每个平板倒入培养皿容量三分之一左右的培养基，将培养皿水平放置待培养基完全冷却凝固制成普通察氏固体培养基平板和20%高糖察氏固体培养基平板(用于菌落的分离纯化培养)后放入冰箱4 ℃冷藏备用。(2)固体培养基斜面的浇制。将配制好的普通察氏培养基分装到试管中，每支试管约装10 mL培养基，盖上硅胶塞，每7只试管为1捆，用皮筋扎好，然后用牛皮纸包好，在121 ℃条件下灭菌20 min，灭菌完成后15°倾斜放置在超净工作台上，冷却凝固制成普通察氏固体培养基斜面(用于纯化菌种的繁殖保种)后放入冰箱4 ℃冷藏备用。

1.2.3 桑叶茯砖茶“金花”菌(S1)的分离、纯化取桑叶茯砖茶25 g，放置在盛有玻璃珠和225 mL无菌水的500 mL锥形瓶中，在摇床中恒温震荡，相关参数为温度28 ℃，转速180 r/min，时间20 min，使菌落分散，用纱布过滤除去残渣，以滤液为10-1液。在超净工作台上，用灭菌水进行梯度稀释，将滤液分别稀释为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6液，每个梯度溶液取0.5 mL分别涂布于普通察氏固体培养基平板上，做好标记并封口，静置10 min后，倒置于28 ℃恒温培养箱中。待长出单个菌落后观察其生长情况，适时对长势较好的“金花”菌菌落进行划线分离，经多次划线分离，待菌种纯化后转接到普通察氏固体培养基斜面上，培养7 d后转入4 ℃冰箱保存备用。

1.2.4 S1的培养与菌落形态观察在超净工作台上将4 ℃冰箱保存的纯化后菌种取出，在常温下复苏24 h后，分别接种于普通察氏固体培养基平板和20%高糖察氏固体培养基平板上，置于28 ℃恒温培养箱中培养，每天观察菌落的生长状况，并做好记录、拍照。

1.2.5 S1的光学显微镜观察采用直接插片观察和形态学观察的方法[15]。普通察氏固体培养基平板接种时，将灭菌的盖玻片靠近接种点5 mm处呈45°～50°斜插入普通察氏固体培养基平板中；从第3天起，每隔1 d对S1菌落的菌株生长情况进行观察。待菌丝扩展至盖玻片处(盖玻片上有明显的菌丝体覆盖)时将其取下，在载玻片上滴1滴棉兰染色液(棉兰染色液的配方如下：石炭酸10 g，乳酸10 mL，蒸馏水10 mL，加棉蓝染色剂0.22 g)，小心将盖玻片有菌丝体的一面正对着载破片上的棉兰染色液，轻轻盖上避免产生气泡，染色5 min后于光学显微镜下观察。

1.2.6 S1的扫描电镜观察取普通察氏固体培养基平板培养7～14 d的S1菌落，从中挑取少许S1菌落制成标本并固定，按常规方法制片后在扫描电镜下观察。

1.2.7 S1的DNA序列分析挑取少量S1菌落，利用植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，扩增引物为ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，扩增S1菌株的ITS区序列，用PCR产物试剂盒回收和纯化，最后送交生工生物工程(上海)有限公司进行测序。其顺序的相似性在NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库中使用BLAST工具进行比较。

2 结果与分析

2.1 S1的菌落形态和生长特性

S1在普通察氏固体培养基平板上28 ℃培养7 d，菌落直径为18～25 mm，菌落较致密，边缘淡黄色，中央部分为浅褐色，呈不规则圆形，菌落周围和背面开始产生色素，有黄色晕圈(图1 S1-A左)。在20%高糖察氏固体培养基平板上28 ℃培养7 d，生长较快，菌落直径达40～55 mm，呈不规则圆形，菌落周围和背面没有明显的色素产生，边缘金黄色(图1 S1-A右)。在普通察氏固体培养基平板上28 ℃培养14 d，菌落直径为28～35 mm，呈圆形或近圆形，菌落边缘呈浅黄色，中间呈浅褐色或褐色，均开始产生褐色晕圈(图1 S1-B)。在普通察氏固体培养基平板上28 ℃培养21 d，菌落直径为46～62 mm，呈金黄色或浅黄色，表面无液滴渗出，菌落致密，平、薄无隆起，整个平板充满茶褐色色素(图1 S1-C)。

S1-A.左为普通察氏固体培养基，右为20%高糖察氏固体培养基(28 ℃，7 d)；S1-B.普通察氏固体培养基(28 ℃，14 d)；S1-C. 普通察氏固体培养基(28 ℃，21 d)。图1 普通与高糖察氏固体培养基平板的S1菌落形态

2.2 S1的光学显微镜显微特征

由图2可以看出，在光学显微镜下S1的分生孢子向外呈放射状生长，链簇在一起，呈扫把状(图2 S1-D)。S1的分生孢子头均呈疏松放射形，顶囊较大(图2 S1-E)。其有性生殖结构以闭囊壳为主，在光学显微镜下观察S1的染色闭囊壳，发现S1的闭囊壳为球形、扁球形或椭球形，大小100～175 μm，闭囊壳里可以清晰看到子囊(图2 S1-F)。S1的未染色闭囊壳丛生在菌丝体中间，均为球形，颜色为金黄色(图2 S1-G)。

S1-D.S1的分生孢子，S1-E.S1的分生孢子及顶囊，S1-F.S1的染色闭囊壳，S1-G.S1的未染色闭囊壳。图2 S1的光学显微镜显微特征

2.3 S1的扫描电镜显微特征

由图3可以看出，在扫描电镜下S1的闭囊壳为近球形，存在于黄色具饰菌丝网中，直径为100～150 μm，S1的闭囊壳无规律破裂释放出子囊(图3 S1-H)；S1的每个子囊内均含有8个子囊孢子，直径为9～14 μm(图3 S1-I)。S1的子囊孢子呈双凸镜形，“赤道”部分具有明显的沟和2个明显的纵向鸡冠状凸起，宽约为0.8～1.1 μm，S1的子囊孢子体大小为5.2～6.3 μm×4.3～5.1 μm，凸面较粗糙，具有尖疣(图3 S1-J)。S1的菌丝体为有分枝的丝状长管，有隔，每隔有细胞核；菌丝体周围布满小丝(图3 S1-K)。

S1-H.S1的闭囊壳释放子囊，S1-I.S1的子囊，S1-J.S1的子囊孢子，S1-K.S1的菌丝体。图3 S1的扫描电镜显微特征

2.4 S1的分子鉴定结果

利用引物ITS1和ITS4扩增S1菌株的ITS区序列，该序列片段为426 bp,在NCBI数据库中利用BLAST进行对比，结果显示扩增S1菌株的ITS片段与数据库中的冠突散囊菌[Eurotiumcristatum(Accession：NO.KR812327.1)]有100%的相似性，由此确认该桑叶茯砖茶“金花”菌株S1为冠突散囊菌。

3 小结与讨论

桑叶是国家卫生部门认定的药食同源植物叶，桑叶茯砖茶是茯砖茶家族的创新品种。本试验以形态结构为主要分类依据，首次对S1进行分离培养，通过普通光学显微镜和电子显微镜对其菌落形态、分生孢子、闭囊壳、子囊孢子等进行观察，从菌落形态和生长特性、光学显微镜与扫描电镜显微特征可以看出，S1具有下述特征：菌落周边黄色，或近于橄榄浅黄色，中心部分颜色较深，近于褐色；闭囊壳量大，黄色。在普通察氏固体培养基平板上28 ℃培养21 d菌落颜色变成橄榄褐或丁香褐，菌落背面黑褐色。在20%高糖察氏固体培养基平板上28 ℃培养生长较快，闭囊壳和子囊球形或近球形；子囊孢子双凸镜形，具有2个明显的纵向鸡冠状突起，凸面表面明显粗糙，具尖疣。对照《中国真菌志》(第五卷)[13]，S1具有冠突散囊菌的典型特征，结合DNA序列分析，根据相关学者关于不同亲缘关系研究成果[14-18]，可以判断桑叶茯砖茶“金花”菌S1为真菌门(Fungi)子囊菌纲(Ascomy cetes)真子囊菌亚纲(Euascomycetes)曲霉目(Eurotiales)曲霉科(Eurotiaceae)散子囊菌属(EurotiumLink ex Fires )冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)。

传统茶叶茯砖茶是在前期渥堆时通过曲霉、青霉、根霉、酵母菌等多种微生物的发酵作用转化黑毛茶的内含成分后，再经人工控制发酵条件使“金花”菌成为优势菌，最终形成其独特的品质[19]。冠突散囊菌能分泌胞外酶并与茶叶本身的酶协同作用，分解黑毛茶中的单宁和淀粉等，使茶黄素(TF)、茶红素(TR)和茶褐素(TB)含量升高，蔗糖、茶多酚、儿茶素总量逐渐减少，从而完成茯砖茶风味物质的转化，形成茯砖茶特有的滋味；“金花”菌菌丝体本身含有丰富的、几乎所有人体必需的氨基酸，具有浓郁的菌花香且能分泌水溶性色素，在增强茶营养及其风味的同时，还能改善茶汤的颜色和香气[20-27]。本试验开展S1的鉴定，为借鉴传统茯砖茶茶叶的相关研究成果，开展桑叶茯砖茶品质形成机理、功能性作用及其加工工艺比较研究奠定了基础。不仅为桑资源利用和茶产业发展开辟了新的途径，也为桑、茶跨学科深入研究搭建了广阔舞台。

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