王晓明,范慧康，刘 旸，温得中

(1.吉林省人民医院 病理科，吉林 长春130021;2.吉林大学临床医学院，吉林长春130021；3.吉林大学基础医学院，吉林 长春130021)

*通讯作者

靶向敲除WT1基因诱导人肺癌A549细胞凋亡

王晓明1,范慧康2，刘 旸2，温得中3*

(1.吉林省人民医院 病理科，吉林 长春130021;2.吉林大学临床医学院，吉林长春130021；3.吉林大学基础医学院，吉林 长春130021)

WT1(Wilms’ Tumor Gene 1)基因是一种与癌症密切相关的基因，最早发现于肾母细胞瘤中[1]。WT1基因主要功能是调节RNA转录后加工的过程，同时具有抑制细胞分裂和分化的功能[3,4]。有研究表明，在乳腺癌、急性髓系白血病、恶性黑色素瘤等疾病中，WT1均存在异常高表达的情况，提示WT1可能是诱导肿瘤发生的一个重要因素，抑制/沉默WT1基因的表达，将有望控制相关肿瘤细胞的发生发展[5]。

CRISPR/Csa9技术是第三代基因编辑工具，其原理是通过gRNA引导，利用Cas9蛋白靶向切割基因组DNA，进而达到基因敲除的目的[6,7]。本研究利用CRISPR/Csa9技术，针对WT1基因的第一外显子区域设计gRNA，拟在人肺癌A549细胞中靶向敲除WT1基因，观察WT1基因敲除对A549细胞的生物学影响、在分子水平上进一步探索WT1基因与细胞凋亡的相关机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株和主要试剂

人肺癌A549细胞和px459载体由北华大学医学检验学院免疫教研室提供并保存。DMEM培养基和胎牛血清购自美国HyClone公司。Bbs I，Solution I购自美国Thermo Scientific公司。Bcl-2，Bax，TP53，β-actin抗体均购自美国Santa Cruz公司。质粒试剂盒，DNA提取试剂盒，BCA定量试剂盒，嘌呤霉素，Trizol A+试剂，DH5α，2 × Taq Plus PCR Master Mix均购自北京天根公司。荧光定量试剂盒，反转录试剂盒购自杭州博日公司。蛋白提取试剂盒购自上海碧云天公司。……