胡鹏飞　　陆明　　黄抒伟

[摘要] 目的 研究自噬在丹参酮ⅡA抑制晚期糖基化产物（AGEs）诱导内皮细胞凋亡中的作用及相关机制。 方法 丹参酮ⅡA及AGEs处理内皮细胞，MTT法检测细胞活性，流式细胞术检测细胞凋亡率，Western blot检测相关蛋白量表达。 结果 与对照组相比，AGEs组和丹参酮ⅡA组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达增加，SQSTM1/p62表达减少，AGEs+丹参酮ⅡA组LC3-Ⅱ表达进一步增加，SQSTM1/p62表达进一步下降。与对照组相比，AGEs组细胞凋亡率增加，细胞活性下降，与AGEs组相比，AGEs+丹参酮ⅡA组细胞凋亡率下降，细胞活性增加，AGEs+自噬抑制剂3-MA组细胞凋亡率增加，细胞活性下降。丹参酮ⅡA组p-AKT、p-mTOR表达下降，呈时间依赖性。 结论 丹参酮ⅡA通过增强自噬抑制AGEs诱导的内皮细胞凋亡，这可能与其抑制AKT/mTOR信号通路相关。

[关键词] 丹参酮ⅡA；晚期糖基化产物；自噬；内皮细胞；细胞凋亡

[中图分类号] R363.21 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）21-0028-05

Tanshinone ⅡA suppresses AGEs-induced endothelial cell apoptosis by enhancing autophagy

HU Pengfei LU Ming HUANG Shuwei

Department of Cardiology， Zhejiang Xinhua Hospital， Zhejiang Traditional Chinese Medicine University Second Affiliated Hospital， Hangzhou 310005， China

[Abstract] Objective To study the effect and mechanism of autophagy in tanshinone ⅡA suppressing AGEs-induced endothelial cell apoptosis. Methods Endothelial cells were managed by tanshinone ⅡA and AGEs， MTT was used to detect cell viability， FCM was used to detect cell apoptosis rate， and Western blot was used to detect protein expression. Results Compared with the control group， the expression of autophagy-associated protein LC3-Ⅱ was enhanced in the AGEs group and the tanshinone ⅡA group， and the expression of SQSTM1/p62 was reduced. The expression of LC3-Ⅱ was further enhanced in the AGEs+tanshinone ⅡA group， and the expression of SQSTM1/p62 was further reduced. Compared with the control group， the rate of cell apoptosis was enhanced， and the cell viability was reduced in the AGEs group. Compared with the AGEs group， the rate of cell apoptosis was reduced and the cell viability was enhanced in the AGEs+tanshinone ⅡA group， and the rate of cell apoptosis was enhanced and the cell viability was reduced in the AGEs+autophagy inhibitor 3-MA group. The expressions of p-AKT and p-mTOR were reduced in the tanshinone ⅡA group， with time dependence. Conclusion Tanshinone ⅡA suppresses AGEs-induced endothelial cell apoptosis by enhancing autophagy， which may be associated with its suppression of AKT/mTOR signal channel.

[Key words] Tanshinone ⅡA； AGEs； Autophagy； Endothelial cell； Apoptosis

晚期糖基化产物（advanced glycation end products，AGEs）是指大分子物质如蛋白质、核酸或脂质在无酶的条件下与其他还原单糖形成的共价化合物，在体内随年龄增加而逐漸蓄积，在糖尿病尤其糖尿病并发症、尿毒症、动脉粥样硬化、衰老等病理生理过程中起着非常重要的作用[1]。自噬是细胞自身降解大分子或损伤细胞器，维持细胞正常代谢，当细胞自噬水平增强时，自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达增加，SQSTM1/p62表达下降，本试验以此作为判断自噬水平的标准[2]。我们前期研究发现AGEs能诱导内皮细胞自噬水平升高，自噬做为保护性机制能抑制AGEs诱导的内皮细胞凋亡[3]。为进一步探讨是否存在药物对这一病理过程有干预作用，通过MTT、Western blot、流式细胞术等方法，对丹参酮ⅡA抑制AGEs诱导的内皮细胞凋亡及相关机制进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

抗LC3-Ⅰ/Ⅱ多克隆抗体、3-MA、MTT、小牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）、D-葡萄糖均购于Sigma公司；雷帕霉素靶磷酸化蛋白多克隆抗体（phospho-mammalian target of rapamycin，p-mTOR）、激酶B磷酸化蛋白多克隆抗體（phospho-protein kinase B，p-AKT）、雷帕霉素靶蛋白多克隆抗体（mammalian target of rapamycin，mTOR）、蛋白激酶B多克隆抗体（protein kinase B，AKT）购自Cell Signaling Technology公司；DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司；细胞内毒素检测试剂盒购自上海润成公司；Alexa Fluor 488 Annexin V/PI凋亡试剂盒购自Invitrogen公司；人脐静脉内皮细胞株（human umbilical endothelial cells，HUVECs）购自中科院上海细胞库。

1.2 方法

1.2.1 HUVECs的培养 HUVECs接种于含青链霉素双抗及10%胎牛血清的DMEM培养液中，37℃、5% CO2培养箱常规培养，平均2天更换1次培养液，用0.25%胰酶（含EDTA）消化传代，等待细胞贴壁24 h后加入AGEs等各项处理因素。

1.2.2 AGEs的制备 参照文献[4]，将6.0 g D-葡萄糖和1 g BSA溶解于20 mL的0.5 mol/L PBS溶液中，0.22 μm滤器除菌后37℃培养箱内锡纸包裹避光孵化3个月。在同等情况下，用不含葡萄糖PBS缓冲液溶解BSA作为对照组，检测所有成品内毒素含量<2.5 U/mL。

1.2.3 Western blot检测蛋白 Western blot检测LC3-Ⅰ/Ⅱ、SQSTM1/p62、p-AKT、p-mTOR、mTOR、AKT。按各组处理后收集细胞，用RIPA裂解液裂解后提取上清蛋白，通过BCA法定量，与5×loading buffer混合，煮沸5 min使蛋白变性。将上样蛋白（40～50 μg）通过SDS-聚丙烯凝胶电泳，转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭60 min，相应LC3-Ⅰ/Ⅱ、SQSTM1/p62、p-AKT、p-mTOR、mTOR、AKT抗体孵膜过夜。TBS-T洗涤3次，加入HRP标记二抗共孵育1 h，按1∶1配置化学发光液，使用LAS-4000-mini化学发光系统成像并进行蛋白条带灰度值分析。

1.2.4 MTT比色法检测内皮细胞活性 将HUVECs传代后接种于96孔细胞培养板中，待细胞贴壁24 h后分别加入3-MA（2 mmol/L）、AGEs、丹参酮ⅡA（10 μg/mL）等处理因素，每组5复孔，最终细胞培养液体积200 μL。培养48 h后加入20 μL MTT溶液（浓度5 mg/mL），培养箱中培养4 h后吸弃上清，加入100 μL DMSO溶解沉淀，摇床振荡5 min，于570 nm波长酶标仪测定吸光度值。

1.2.5 Alexa Fluor 488 Annexin V/PI 双染标记法检测细胞凋亡 将对数生长期HUVECs接种于6孔板中（密度：2.0×105/well），贴壁24 h后分别加入AGEs、丹参酮ⅡA（10 μg/mL）、3-MA（2 mmol/L）等处理因素并收集细胞。按Alexa Fluor 488 Annexin V/PI 凋亡试剂盒说明书操作，重悬细胞后用流式细胞仪FACS Calibur检测，流式结果通过软件BD Cell Quest分析。

1.3 统计学处理

所有实验数据均来自3次以上独立实验结果，计量资料以（x±s）表示，采用SPSS16.0软件进行统计学分析，两组间计量资料两两比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AGEs及丹参酮ⅡA对内皮细胞自噬水平的影响

为明确AGEs及丹参酮ⅡA对内皮细胞自噬水平的影响，用100 μg/mL AGEs或10 μg/mL 丹参酮ⅡA处理HUVECs 6 h，与对照组比较，AGEs组及丹参酮ⅡA组的自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达量增加，p62表达量下降；AGEs+丹参酮ⅡA组LC3-Ⅱ蛋白表达量继续增加，p62蛋白表达量继续下降（P<0.05）（图1）。以上结果表明AGEs及丹参酮ⅡA均能诱导人脐静脉内皮细胞自噬水平升高，并有叠加效应。

2.2 丹参酮ⅡA对AGEs诱导内皮细胞凋亡的影响

2.2.1 MTT比色法测定细胞活性 100 μg/mL的AGEs处理内皮细胞48 h，一组与10 μg/mL丹参酮ⅡA共孵育，一组用2 mmol/L 浓度3-MA（自噬抑制剂）提前预处理30 min，与对照组比较，AGEs组内皮细胞活性下降，丹参酮ⅡA组较AGEs组细胞活性升高，3-MA组较AGEs组细胞活性下降，抑制自噬后导致内皮细胞损伤进一步加重。结果表明丹参酮ⅡA能够抑制AGEs诱导的内皮细胞损伤，自噬在AGEs诱导的内皮细胞损伤中起保护作用。见图2。

2.2.2 Alexa Fluor 488 Annexin V/PI双染标记法检测细胞凋亡 100 μg/mL的AGEs处理内皮细胞48 h，一组与10 μg/mL丹参酮ⅡA共孵育，一组用自噬抑制剂3-MA（2 mmol/L）提前30 min共培养预处理，AGEs组细胞凋亡率明显升高，丹参酮ⅡA组较AGEs组细胞凋亡率下降，3-MA组较AGEs组细胞凋亡率升高，抑制自噬加剧AGEs诱导内皮细胞凋亡。以上结果表明丹参酮ⅡA能够降低AGEs诱导的内皮细胞凋亡，自噬在AGEs诱导的内皮细胞凋亡中起保护作用。

2.3 丹参酮ⅡA对AKT/mTOR信号通路的作用

为明确丹参酮ⅡA对AKT/mTOR信号通路的影响，我们用10 μg/mL丹参酮ⅡA处理HUVECs，在不同时间点收集细胞（0.5 h、1 h），p-AKT和p-mTOR的表达水平随着作用时间的延长而下降，说明丹參酮ⅡA能够抑制AKT/mTOR信号通路，并呈时间依赖性（P<0.05）。见图4。

3讨论

血管内皮是血管内壁表层由单层内皮细胞构成的薄膜，是血管壁的屏障。血管内皮细胞损伤与凋亡导致的血管屏障破坏是动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的初发病理环节之一[5]。糖尿病患者因代谢异常导致AGEs蓄积，AGEs可通过直接效应或与其受体结合的间接作用导致内皮细胞损伤及凋亡，增加细胞促凝活性，影响内皮细胞舒张功能，并最终导致血管通透性增加，顺应性下降，加速动脉粥样硬化过程[6，7]。

丹参酮ⅡA（Tanshinone ⅡA，TⅡ A）是从植物丹参中提取出来的单体成分，具有活血化瘀通络的作用，从西医角度其具有扩血管、抗血小板聚集、抗炎、抑制细胞凋亡与增殖、抗氧化自由基、增加冠脉血流、促进冠脉侧支循环形成、降低血压黏度、改善血液流变学等作用，因此在心血管领域有广泛的应用[8-10]。我们通过MTT及流式细胞术发现丹参酮ⅡA能抑制AGEs诱导的内皮细胞凋亡，而调节自噬可能是其发挥保护作用的机制之一。张妮等[11]报道丹参酮ⅡA通过调节自噬小体信号通路形成相关蛋白，对ox-LDL诱导的内皮细胞氧化应激损伤具有保护作用。

细胞自噬广泛存在于真核生物的病理生理过程中，其本身是一个动态的过程：首先，受损的细胞器或大分子被来自内质网的膜延伸包裹形成细胞自噬体，然后与细胞内溶酶体相结合，形成自噬溶酶体，降解所包含内容物供给自身代谢需要并维持细胞稳态[12-14]。适度的自噬是细胞正常生理过程所必需的，但过度的自噬可能对细胞有保护作用，也可能加速细胞损伤，在疾病的不同阶段，自噬的作用也不同，在缺血/再灌注损伤中，缺血阶段心肌细胞自噬增强，高水平的自噬对心肌细胞具有保护作用，减少心肌细胞损伤，进入再灌注阶段后，细胞自噬水平进一步升高，此时过度增强的自噬对心肌细胞造成进一步损伤[15]。多种信号通路能调控细胞自噬水平，其中mTOR（mechanistic target of rapamycin，mTOR）相关信号通路的研究较为透彻，也是最重要的一条通路，mTOR是一个保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，当其磷酸化水平升高后对自噬水平进行负性调节，在mTOR上游，AKT通过TSC1/2（tuberous sclerosis1/2）或PRAS40依赖的途径激活mTOR，对mTOR进行正向调节并抑制自噬[16-18]。

Verma N等[19]报道晚期糖基化产物通过激活RAF蛋白激酶及NF-κB从而激活细胞自噬水平。Ma M等[20]研究发现晚期糖基化产物通过减少组织蛋白酶D促进大鼠血管平滑肌细胞增殖并抑制其自噬水平。Takahashi A等[21]发现自噬通过抑制肾脏近端小管溶酶体形成和功能从而抑制晚期糖基化产物的蓄积。本课题小组一直从事自噬与AGEs导致的心血管并发症相关研究。前期研究发现：AGEs诱导的自噬参与AGEs诱导的血管平滑肌细胞增殖，其中AKT和ERK/MAPK信号通路发挥了重要作用[22]；AGEs通过AKT/mTOR和ERK/MAPK信号通路诱导乳鼠心肌细胞自噬水平升高，通过AKT/mTOR和P38/MAPK信号通路诱导乳鼠心肌细胞凋亡增加，自噬在AGEs诱导的心肌细胞凋亡中起保护作用[23]；AGEs诱导内皮细胞自噬水平增强，增强的自噬能抑制AGEs诱导的内皮细胞凋亡[3]。通过实验，我们发现丹参酮ⅡA能对抗AGEs诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡，其机制可能是通过调节AKT/mTOR信号通路从而调节细胞自噬水平。

[参考文献]

[1] Ejtahed HS，Angoorani P，Asghari G，et al. Dietary advanced glycation end products and risk of chronic kidney disease[J]. Journal of Renal Nutrition：The Official Journal of the Council on Renal Nutrition of the National Kidney Foundation，2016，26：308-314.

[2] Ng KM，Mok PY，Butler AW，et al. Amelioration of X-linked related autophagy failure in danon disease with DNA methylation inhibitor[J]. Circulation，2016，134：1373-1389.

[3] 胡鹏飞，赖东武，何红. 自噬在晚期糖基化产物诱导的内皮细胞凋亡中的作用[J]. 中国病理生理杂志，2012， 28（6）：1006-1011.

[4] Hou FF，Chertow GM，Kay J，et al. Interaction between beta 2-microglobulin and advanced glycation end products in the development of dialysis related-amyloidosis[J].Kidney International，1997，51：1514-1519.

[5] Angoorani P，Ejtahed HS，Mirmiran P，et al. Dietary consumption of advanced glycation end products and risk of metabolic syndrome[J]. International Journal of Food Sciences and Nutrition，2016，67：170-176.

[6] Gudmundsson G，Margretardottir OB，Sigurdsson MI，et al. Airflow obstruction，atherosclerosis and cardiovascular risk factors in the AGEs Reykjavik study[J]. Atherosclerosis，2016，252：122-127.

[7] Belmokhtar K，Robert T，Ortillon J，et al. Signaling of serum amyloid a through receptor for advanced glycation end products as a possible mechanism for uremia-related atherosclerosis[J]. Arteriosclerosis，Thrombosis，and Vascular Biology，2016，36： 800-809.

[8] 曹甜甜，徐海麗，贺延. 丹参酮ⅡA磺酸钠治疗冠心病的疗效及对血液流变学、细胞因子和血脂水平的影响[J].心血管康复医学杂志，2017，26（1）：104-107.

[9] 王琳莉，黄抒伟，窦丽萍，等. 丹参酮ⅡA磺酸钠对兔急性心梗再灌注后无复流的保护作用[J]. 中华中医药学刊，2016，24（3）：678-682.

[10] 任爽，李必迅. 丹参酮对冠心病患者血液动力学指标及血脂水平的影响[J]. 辽宁中医药大学学报，2015，17（7）：211-212.

[11] 张妮，曹慧敏，宋囡，等. 丹参酮ⅡA通过调节自噬小体对ox-LDL诱导内皮细胞氧化应激损伤的保护作用[J].中国动脉硬化杂志，2017，25（3）：244-249.

[12] Kimmelman AC，White E. Autophagy and tumor metabo-lism[J]. Cell Metabolism，2017，25：1037-1043.

[13] Miyamoto S，Brown JH. Drpl and mitochondrial autophagy lend a helping hand in adaptation to pressure overload[J]. Circulation，2016，133：1225-1227.

[14] Yang KC，Ma X，Liu H，et al. Tumor necrosis factor receptor-associated factor 2 mediates mitochondrial autophagy[J]. Circulation Heart Failure，2015，8：175-187.

[15] Matsui Y，Takagi H，Qu X，et al. Distinct roles of autophagy in the heart during ischemia and reperfusion：Roles of AMP-activated protein kinase and Beclin 1 in mediating autophagy[J]. Circulation Research，2007，100：914-922.

[16] Yang B，Zhao S. Polydatin regulates proliferation，apoptosis and autophagy in multiple myeloma cells through mTOR/p70s6k pathway[J]. Onco Targets and Therapy，2017， 10：935-944.

[17] Dong H，Jing W，Runpeng Z，et al. ESAT6 inhibits autophagy flux and promotes BCG proliferation through MTOR[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2016，477：195-201.

[18] He Q，Sha S，Sun L，et al. GLP-1 analogue improves hepatic lipid accumulation by inducing autophagy via AMPK/mTOR pathway[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2016，476：196-203.

[19] Verma N，Manna SK. Advanced glycation end products（AGE）potently induce autophagy through activation of RAF protein kinase and nuclear factor kappaB（NF-kappaB）[J]. The Journal of Biological Chemistry，2016，291：1481-1491.

[20] Ma M，Guo X，Chang Y，et al. Advanced glycation end products promote proliferation and suppress autophagy via reduction of Cathepsin D in rat vascular smooth muscle cells[J]. Molecular and Cellular Biochemistry，2015， 403：73-83.

[21] Takahashi A，Takabatake Y，Kimura T，et al. Autophagy inhibits the accumulation of advanced glycation end products by promoting lysosomal biogenesis and function in the kidney proximal tubules[J]. Diabetes，2017，66：1359-1372.

[22] Hu P，Lai D，Lu P，et al. ERK and Akt signaling pathways are involved in advanced glycation end product-induced autophagy in rat vascular smooth muscle cells[J]. International Journal of Molecular Medicine，2012，29：613-618.

[23] Hu P，Zhou H，Lu M，et al. Autophagy plays a protective role in advanced glycation end product-induced apoptosis in cardiomyocytes[J]. Cellular Physiology and Biochemistry：International Journal of Experimental Cellular Physiology，Biochemistry，and Pharmacology，2015，37：697-706.

（收稿日期：2017-05-11）