徐明明，李建超，刘益飞，刘俊华

1.南通大学附属医院心胸外科，江苏南通 226000；2.盐城市第一人民医院急诊科，江苏盐城 224006；3.南通大学附属医院心胸外科病理科，江苏南通 226000

FOXO4在非小细胞肺癌中的表达及意义

徐明明1，李建超2，刘益飞3，刘俊华1

1.南通大学附属医院心胸外科，江苏南通 226000；2.盐城市第一人民医院急诊科，江苏盐城 224006；3.南通大学附属医院心胸外科病理科，江苏南通 226000

目的 探讨FOXO4在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的表达及其临床意义。 方法 方便选取南通大学附属医院心胸外科2005年3月—2007年3月手术切除的150例NSCLC标本及20例正常肺组织标本，应用SP法分别检测FOXO4表达情况，并分析NSCLC组织中FOXO4表达与临床病理特征之间的关系。结果FOXO4在肿瘤组织中阳性表达率为42.67%，明显低于正常肺组织的80.00%（P＜0.01）。FOXO4在肿瘤组织中的表达与性别、年龄、吸烟、肿瘤大小和病理分型之间差异无统计学意义（P>0.05）；但与分化程度、淋巴结转移和TNM分期之间密切相关（P＜0.05）。其中高、中分化组FOXO4阳性表达率(62.50%;50.00%)明显高于低分化组(25.00%)（P=0.004）；无淋巴结转移组表达率(80.00%)明显高于淋巴结转移组(29.09%)（P＜0.01）；TNMⅢ期组表达率(7.32%)明显低于Ⅰ、Ⅱ期组(77.50%;43.48%)（P＜0.01）结论FOXO4在NSCLC中低表达，提示其可能为抑癌基因。

FOXO4；非小细胞肺癌；免疫组织化学

随着环境污染的加重，肺癌的发病率及死亡率呈急剧上升趋势。肺癌的5年生存率低于乳腺癌和大肠癌，仅为15%。FOXO转录因子是叉头框（Forkhead box,FOX）家族中的一员，通过调节靶基因的转录，参与调控细胞周期、凋亡、分化等过程[1]。FOXO4是FOXO亚家族中的成员，在胃癌、大肠癌中的表达都有所下调或缺失，表明多种机制导致的FOXO4失活可能促进了肿瘤的发生发展[2-3]。该研究应用免疫组化法检测FOXO4在NSCLC中的表达情况，并分析其与临床病理特征之间的关系，试图阐明FOXO4在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）发生发展中的作用机制。方便收集南通大学附属医院心胸外科2005年3月—2007年3月手术切除NSCLC标本150例，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

NSCLC标本150例，其中男122例，女28例；中位年龄64岁；鳞癌97例，腺癌41例，腺鳞癌12例；肿瘤≤3 cm 45例，＞3 cm 105例；高分化16例，中分化82例，低分化52例；淋巴结转移110例，无转移40例；Ⅰ期40例、Ⅱ期69例，Ⅲ期41例。正常肺组织20例，取自癌灶远处，诊断无癌细胞浸润。所有标本制备成组织微阵列（TMA）。

1.2 方法

1.2.1 TMA制作 TMA是选取有代表性的组织部分，顺序排列在载体上而制备成微缩组织阵列。在蜡块中标记代表性部位；石蜡与蜂蜡混合，制备成空白蜡块，芯片仪蜡块上打孔；将供体蜡块软化，细针钳取代表性组织转移至空白打孔蜡块上；制备成组织芯片。

1.2.2 FOXO4蛋白检测 采用免疫组化 SP法检测FOXO4蛋白表达。切片脱蜡、脱水；热修复抗原；消除内源性过氧化物酶活性；正常羊血清封闭；滴加兔抗人单克隆抗体FOXO4；滴加二抗；滴加辣根酶标记链霉卵白素；DAB显色；苏木素复染；盐酸酒精分化；PBS液返蓝；梯度酒精脱水；二甲苯浸泡透明；封片；已知标本作阳性对照，PBS液代替一抗作阴性对照。

1.2.3 结果判定 采用双盲法对结果进行评估。FOXO4蛋白表达主要位于细胞核，阳性染色呈棕黄色或棕褐色；高倍镜下每张切片选取5个视野，每视野计数100个肿瘤细胞。FOXO4蛋白根据染色强度和阳性细胞百分比进行评分，染色强度分数标准：细胞无着色0分、淡棕色1分、棕色2分、棕褐色3分；同物镜下计数阳性细胞数：0分，阳性细胞数比率﹤1%；1分，比率2%～25%；2分，比率26%～50%；3分，比率51%～75%；4分，比率﹥75%。两项得分相乘：0～3分为 “-”；4～6分为“+”；7～9分为“++”；10～12分为“+++”。“+～+++”。

1.3 统计分析

运用SPSS 17.0统计学软件分析，计数资料采用χ2检验，用[n（%）]表示，P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FOXO4在NSCLC和正常肺组织中的表达

FOXO4蛋白表达主要位于细胞核，阳性染色呈棕褐色或棕黄色。150例NSCLC组织中，FOXO4蛋白阳性率42.67%，明显低于正常对照组（80.00%）(P＜0.01)。图1A、图1B、图1C分别可见正常肺细胞、鳞癌细胞及腺癌细胞的细胞核内棕褐色颗粒沉积。

图1A 正常肺组织FOXO4染色阳性（SP×40/400）

图1B 鳞癌组织FOXO4染色阳性（SP×40/400）

图1C 腺癌组织FOXO4染色阳性（SP×40/400）

2.2 FOXO4表达与NSCLC临床病理特征的关系

FOXO4在NSCLC中的表达与性别、年龄、吸烟、肿瘤大小和肿瘤类型之间无明显相关性（P＞0.05），而与肿瘤的分化程度、淋巴结转移和TNM分期密切相关（P﹤0.05），见表1。

3 讨论

肺癌的发生发展由癌基因、抑癌基因及其它因子共同参与。通过研究转录因子FOXO4，以期有助于阐明FOXO4在NSCLC发生发展过程中的作用机制。FOXO4是FOXO亚家族中的成员之一，FOXO4的DNA结合域具有特征性结构：3个α螺旋、3个β链及2个翅膀状大环[4]。FOXO4存在于人体组织器官中，其中心脏、骨骼肌中呈高水平表达。此外，FOXO4还与多种肿瘤的发生发展密切相关，如乳腺癌、大肠癌、胃癌。

磷酸化是FOXO4蛋白最重要的翻译后修饰。在胰岛素生长存活因子刺激下，PI3K-PKB/SGK信号通路激活，PKB和SGK进入细胞核后对FOXO4蛋白产生磷酸化，其位点为 Thr32、Ser197、Ser262，导致磷酸化的FOXO4蛋白出核并滞留于细胞质，进而抑制靶基因的转录。14-3-3特异性结合磷酸化的FOXO4，通过干扰核定位序列以及诱导FOXO4构象改变，使其暴露出核输出序列并与核外运蛋白作用，促进FOXO4蛋白出核失活[5]。转录因子FOXO4除接受磷酸化、乙酰化修饰外，O位N-乙酰葡萄糖胺糖基化和单泛素化也是其重要的修饰方式，并且在生命活动中起重要作用[6]。

表1 FOXO4表达与临床病理特征的关系

机体细胞中，FOXO4蛋白受PI3K/AKT、Ras调控，调节p27kip1和cyclin D的表达，使细胞周期分别停滞于G1、S期，进而抑制细胞增殖。缺氧诱导因子HIF-1α表达增加诱导血管生成、糖代谢、红细胞生成等相关基因的表达，而这些是肿瘤增大必需的条件。研究发现，定位于核内的FOXO4通过下调HIF-1α蛋白水平，抑制血管内皮生长因子、葡萄糖载体1和红细胞生成素的表达，从而抑制肿瘤的生长[7]。miR-421在鼻咽癌细胞中通过抑制FOXO4转录活性，使其下游分子如p21、 p27、Bim及Fasl的表达下降，进而促进肿瘤细胞增殖和抵抗细胞凋亡。已知作为抑癌基因的FOXO4，不仅参与阻滞肿瘤细胞周期，还通过多种途径参与细胞凋亡过程。FOXO4通过激活Bim因子，上调Bim蛋白表达水平，从而促进肿瘤细胞凋亡[8]。在非应激条件下的人上皮癌细胞中，siRNA沉默 NAD依赖的脱乙酰酶SIRT1后，FOXO4介导了下游caspase3和caspase7的肿瘤细胞凋亡，而此过程与P53、FOXO3a无关。Lee发现，表皮生长因子介导了FOXO4蛋白磷酸化，使ANXA8表达下降，进而诱导了肿瘤细胞EMT发生，提示FOXO4可能参与肿瘤转移过程[9]。该文发现FOXO4蛋白表达无淋巴结转移组显著高于有淋巴结转移组（80.00%vs 29.09%）(P<0.01)，提示FOXO4参与抑制肿瘤转移。刘向强等[2]发现FOXO4在大肠癌组织中的阳性表达率明显低于癌旁组织 （47.50%vs 91.25%，P< 0.001），提示FOXO4在大肠癌发生发展过程中扮演着抑制因子的作用。该研究采用 SP法检测了 150例NSCLC标本中FOXO4蛋白的表达情况，发现FOXO4蛋白主要分布于细胞核，其表达率明显低于正常肺组织（80.00%vs 42.67%），两组比较差异有统计学意义。

分析NSCLC组织中FOXO4表达与临床病理特征之间的关系，发现FOXO4表达缺失与分化程度、TNM分期和淋巴结转移密切相关，提示FOXO4在NSCLC发生、分化及转移过程中起着抑制作用。因此，该研究认为FOXO4的低表达与NSCLC发生发展密切相关，FOXO4可能为抑癌基因。

[1]Wilk A,Urbanska K,Grabacka M,et al.Fenofibrate-Induced Nuclear Translocation of FoxO3A Triggers Bim-Mediated Apoptosis in Glioblastoma Cells in Vitro[J].Cell Cycle,2012,11(14):2660-2671.

[2]刘向强,汤善宏,张志勇,等.转录因子FOXO4在大肠癌中的表达及意义[J].细胞与分子免疫学杂志,2011,27(9): 969-971.

[3]张超,王德荣,曲飞,等.转录因子FOXO4与胃癌及Hp感染关系的临床研究[J].中国现代普通外科进展,2013,16 (3):210-213.

[4]Vacha P,Zuskova I,Bumba L,et al.Detailed Kinetic Analysis of the Interaction Between the FOXO4-DNA-Binding Domain and DNA.[J].Biophysical Chemistry,2013,184(3): 68-78.

[5]Obsil T,Ghirlando R,Anderson DE,et al.Two 14-3-3 Binding Motifs are Required for Stable Association of Forkhead Transcription Factor FOXO4 with 14-3-3 Proteins and Inhibition of DNA Binding[J].Biochemistry,2014,42(51): 15264-15272.

[6]Ho SR,Wang K,Whisenhunt TR,et al.O-GlcNAcylation Enhances FOXO4 Transcriptional Regulation in Response to Stress[J].Febs Letters,2010,584(1):49-54.

[7]Fu B,Li Y,Zhao Z.The Correlation of HIF-1α,MACC1 and FOXO4 in Gastric Carcinoma Pathology and Prognosis[J]. Chongqing Medicine,2015(9):1180-1183.

[8]Wang W,Zhou PH,Hu W.Overexpression of FOXO4 Induces Apoptosis of Clear-Cell Renal Carcinoma Cells through Downregulation of Bim[J].Molecular Medicine Reports,2016,13(3):2229.

[9]Lee MJ,Yu GR,Yoo HJ,et al.ANXA8 Down-Regulation by EGF-FOXO4 Signaling is Involved in Cell Scattering and Tumor Metastasis of Cholangiocarcinoma.[J].Gastroenterology,2009,137(3):1138.

Expression and Significance of FOXO4 in the Non-small-cell Lung Cancer

XU Ming-ming1,LI Jian-chao2,LIU Yi-fei3,LIU Jun-hua1

1.Department of Cardio-Thoracic Surgery,Hospital Affiliated to Nantong University,Nantong,Jiangsu Province,226000 China；2.Department of Emergency,Yancheng First People’s Hospital,Yancheng,Jiangsu Province,224006 China；3.Department of Cardio-Thoracic Surgery&Department of Pathology,Hospital Affiliated to Nantong University,Nantong,Jiangsu Province,226000 China

ObjectiveTo study the expression and significance of FOXO4 in the non-small-cell lung cancer.MethodsConvenient selection 150 cases of NSCLC specimens and 20 cases of normal lung tissue specimens with operation resection in our hospital from March 2005 to March 2007 were selected and the FOXO4 expression was tested by the SP method and the correlation between the FOXO4 expression in NSCLC tissues and clinical pathological features was analyzed.ResultsThe positive expression rate of FOXO4 in the normal tissues was obviously lower than that in the normal lung tissue, (42.67%vs 80.00%)(P<0.01),and the difference in the expression of FOXO4 in tumor tissues among different genders, ages,smoking,mass sizes and pathological types was not statistically significant(P>0.05),but the expression was closely related to the differentiation degree,lymphatic metastasis and TNM staging(P<0.05),and the positive expression rate of FOXO4 in the high and moderate differentiation groups was obviously higher than that in the low differentiation group(62.50%, 50.00%vs 25.00%),（P=0.004）.and the expression rate in the no lymphatic metastasis group was obviously higher than that in the lymphatic metastasis group,(80.00%vs 29.09%)(P<0.01),and the expression rate in the TNMⅢgroup was obviously lower than that in the TNMⅠ and TNMⅡ groups(7.32%vs 77.50%,43.48%)(P<0.01).ConclusionThe expression of FOXO4 in NSCLC is low,which reminds that it may be the cancer suppressor gene.

FOXO4;Non-small-cell lung cancer;Immunohistochemistry

R734

A

1674-0742（2017）06（c）－0031-04

10.16662/j.cnki.1674-0742.2017.18.031

2017-03-22）

徐明明（1988-），男，江苏南通人，硕士，住院医师，研究方向：胸部肿瘤诊治。