张冬雪程成王蕾王吉天姜彤林梅王左敏

乳香提取物对两种牙周致病菌体外抑菌作用的研究

张冬雪程成王蕾王吉天姜彤林梅王左敏

目的：研究乳香提取物(Extract of Boswellin)对两种常见牙周致病菌的抑菌性，比较乳香提取物及0.2%Gel Gingival hyaluronic acid(GHA)凝胶两种药物对牙周致病菌抑菌性的差异。方法：采用试管二倍稀释法测定乳香提取物对牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)、具核梭菌(Fusobacterium nucleatum Fn)的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)后，用平皿培养法测定两种细菌的最小杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration,MBC)。采用纸片法分别测定质量分数为10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.3125%、0.15625%的乳香提取物及GHA凝胶对以上2种细菌的抑菌环直径，观察随着质量分数增加抑菌环直径的变化；比较两种药物对同一细菌的抑菌性差异，同一浓度的乳香水提取物对2种细菌的抑菌性的差异。结果：乳香提取物对Pg、Fn的MIC分别为0.325%，乳香提取物对Pg的MBC为0.325%，对Fn的MBC为2.5%。随着质量分数增加，抑菌环直径均增大，5%的抑菌环直径最大；同一质量分数的乳香提取物溶液对2种细菌的抑菌环直径不同，差异具有统计学意义；与0.2%GHA凝胶相比，10%乳香提取物的抑菌环直径大，差异具有统计学意义。结论：乳香提取物对2种牙周致病菌均具有一定的抑制作用，对Pg的抑菌作用强于Fn，且5%的乳香提取物对2种牙周致病菌的抑菌性最佳，抑菌作用强于0.2%GHA凝胶。

乳香提取物；抑菌实验；牙周致病菌

慢性牙周炎是细菌感染引起的，牙周支持组织的慢性感染性疾病，其发生发展与牙菌斑和牙结石在牙齿表面的附着密切相关。如何有效控制菌斑的形成，对牙周病的预防和控制具有重要的意义。除了机械性去除菌斑外，因局部用药具有在病变部位浓度高、药效好、可减轻全身用药的不良反应等优点，是牙周病用药的主要方式。因此找到抑菌效果好、作用持久、不易产生耐药性、不良反应小、价格低廉的局部药物，对治疗牙周炎具有重要意义[1]。乳香为橄榄科植物卡氏乳香树(Boswellia carteriibirdw)的胶状树脂，能活血行气、通经止痛、消肿生肌。主要化学成分为树脂60%-70%，树胶27%-35%，挥发油3%-8%。已经有很多研究报道表明乳香提取物具有抗氧化作用、能够抑制肿瘤细胞生长、抑制炎症反应、抑制肺纤维化、抗辐射、改善脑功能、刺激成纤维细胞等作用[2]，但对于牙周疾病的研究却很少。国外学者发现乳香提取物对菌斑性龈炎具有辅助治疗作用。本实验研究不同质量分数的乳香提取物对牙周致病菌的抑制作用，为制备防治牙周病药物提供理论依据。

1.材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌种牙龈卟啉单胞菌(Porhpyromonas gingivalis,Pg)ATCC33277，具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum Fn)ATCC 25586，以上菌种均由首都医科大学附属口腔医学研究所提供。

1.1.2 乳香提取物凝胶橄榄科植物乳香树及其同属植物树皮深处的树脂提取的产物(由首都医科大学附属中药研究所提供)；透明质酸钠凝胶0.2% Gel Gingival hyaluronic acid，由Ricerfarma SRL公司(意大利)提供[4]。

1.1.3 实验样本制备将10%乳香提取物用灭菌注射用水和厌氧液体培养基二倍稀释制成为质量分数为5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.3125%、0.15625%的乳香提取物溶液各一份。

1.1.4 培养基CDC培养基及厌氧液体培养基。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种培养无菌环接种，取2种细菌的冻干粉少许分别溶于生理盐水中混匀，接种于CDC培养基7天，取Pg和Fn的2-3个菌落接种于液体培养基，37℃厌氧培养48h后，用生理盐水稀释，比浊在0.5个麦氏单位，此时菌液的浓度为1.5*108CFU/ml。

1.2.2 试管二倍稀释法测定最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)取试管6支，按照1-6编号，1号管内加入3g的乳香提取物凝胶(质量分数10%)，加入等质量液体培养基的3ml稀释，此时5%乳香溶液4.8ml，灭菌。2-6号管内各加入液体培养基2.4ml。经倍比稀释后1-6号管中的乳香提取物的质量分数依次为5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.3125%及0.15625%。另取14支试管，按照药物浓度编号(001-014)，每2支试管同一浓度，连续编号，分别取1ml乳香溶液，每只试管中加入0.01ml菌液，摇匀，其中最后两只试管分别为生理盐水空白对照(013)和液体培养基阴性对照(014)。37℃厌氧箱培养48h后观察试管中菌液浑浊情况，以抑制细菌生长的所含量最低乳香提取物浓度为MIC。将CDC培养基均分，分别接种相同药物浓度的两种菌液各0.01ml，三线法涂布均匀，培养48h，观察2种细菌的生长情况，以无细菌生长的最低乳香提取物浓度为MBC。本实验重复2次。

1.2.3 纸片法测量抑菌环直径菌液即配即用。按照上述菌种复苏培养的方法将Pg、Fn的菌液比浊在0.5个麦氏单位。用移液枪吸取2种细菌的菌液0.1ml至整个CDC固体培养基中心，用L型涂菌棒涂布均匀：(1)无菌镊子镊取无菌圆形滤纸片，直径为6mm，分别浸入质量分数为5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.3125%及0.15625%已灭菌的乳香提取物溶液30min后，将滤纸片贴于六等分的CDC培养基表面，将培养皿至于37℃厌氧培养箱，48h后用游标卡尺测量抑菌环(包含滤纸片的直径)。实验重复6次。(2)将无菌圆形滤纸片分别浸入质量分数为10%的乳香提取物凝胶、0.2%GHA凝胶及生理盐水30min后，将滤纸片帖于3等分的CDC培养基表面，将培养皿至于37℃厌氧培养箱，48h后用游标卡尺测量抑菌环(包含滤纸片的直径)。实验重复6次。

1.3 统计学方法将测得的抑菌环直径用(x±s)的形式表示。用spss统计软件进行数据。采用ANONA分析比较10%乳香提取物凝胶和0.2% GHA凝胶的抑菌环直径；组间总体比较采用单因素方差分析，比较不同质量分数的药物抑菌作用差异以及同一质量分数的乳香提取物溶液对2种细菌的抑菌性差异；组间比较采用LSD法。以双侧P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 试管二倍稀释法进行药物抑菌后培养细菌，用肉眼比浊法观察，与液体培养基和生理盐水相比，当乳香提取物质量分数为0.15625%时，液体培养基浑浊，测定MIC的结果：乳香提取物溶液对Pg和Fn的MIC均0.325%(图1)。

图1 从左到右液体培养基、生理盐水对照、0.15625%Fn和0.15625%Pg

2.2 当乳香提取物质量分数为0.15625%时，CDC培养基有Pg生长；当质量分数为1.25%时，CDC培养基有Fn生长，由此得出平皿培养法测定MBC的结果：乳香提取物对Pg和Fn的MBC分别为0.325%和2.5%(见图2-图5)。

图20 .15625%Pg

图30 .3125%Pg

图41 .25%Fn

图52 .5%Fn

2.3 试纸片法测得的抑菌环直径结果见表1，表2。

乳香提取物溶液抑菌环直径与质量分数的关系见表1。药物抑菌环直径随质量分数的变化而变化。其中5%质量分数的抑菌环直径最大。2种细菌的抑菌环直径在6个质量分数组间比较，差异具有统计(P＜0.05)。结果显示乳香提取物对2种细菌的抑菌性从强到弱Pg＞Fn。

表1 不同质量分数乳香提取物对2种细菌的作用(x±s)

5%乳香提取物凝胶、0.2%GHA凝胶及生理盐水抑菌环直径比较见表2。

表2 乳香提取物、及生理盐水GHA凝胶对2种细菌的作用(x±s)

3.讨论

牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌被认为是龈下菌斑中主要的可疑致病微生物。并且，这两种细菌是最常见的建立牙周炎动物模型的致病菌，与慢性牙周炎的关系密切。本实验中所选用的两种细菌是其中具有代表性牙周致病菌，Pg为革兰氏阴性专性厌氧菌，是慢性牙周炎病变区域或活动部位最主要的优势菌[3,6]，体外实验表明Pg可粘附于牙周袋上皮，凝集人红细胞，产生较多蛋白水解酶，将蛋白质降解成短链，同时产生大量的内毒素和胶原酶等，从而破坏牙周组织。Fn是介导定植于生物膜上的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌相互作用的中心物种，它被认为是牙齿和上皮表面与病原体之间的媒介，Fn可与多种致病菌共聚协同，产生大量毒素及水解酶，造成牙周支持组织破坏，并且，Fn可使甲硝唑失去抗菌作用，从而促进伴随Pg的粘附和生长[6,7]。

慢性牙周炎是由菌斑引起的牙周支持组织的慢性感染性疾病，因细菌易产生抗药性，所以生物膜感染难以治疗，有研究结果表明，乳香提取物可以有效抑制多种炎症性疾病的细菌生物膜的形成，并且抑制脂氧合酶的作用从而达到抑制肿瘤细胞和诱导细胞凋亡。乳香酸是乳香提取物的重要组成部分，Acetyl-11-keto-boswellic acid(AKBA)和其他的乙酸酯，AKBA是乳香提取物中最活跃的部分，通过5-脂氧合酶途径的选择性非氧化抑制剂。有大量的临床试验证明了，乳香提取物可用于治疗炎症性疾病，如癌症、关节炎、慢性肠炎、溃疡性肠炎、Crohn病、支气管哮喘及口腔溃疡[8-10]。通过乳香提取物对体外培养牙周致病菌抑菌实验发现，乳香提取物对牙周致病菌Pg具有明显的抑菌性，MIC为0.325%，MBC为0.325%，说明极低的药物浓度对慢性牙周炎的主要致病菌Pg，具有抑制细菌生长并杀死细菌的能力。Fn可聚集协同多种细菌最终形成菌斑，实验结果发现，乳香提取物对Fn的MIC为0.325%，MBC为8倍的MIC 2.5%，说明药物对Fn也具有抑制作用，且未产生耐药性。本实验通过测量抑菌环直径发现，随着质量分数的增加5%乳香提取物对两种牙周致病菌的抑菌环直径最大，并且相同药物浓度，Pg的抑菌环直径明显大于Fn,差异具有统计学意义，由此我们可以得出乳香提取物对Pg的抑菌作用强于Fn。乳香具有明显的抗炎作用和抗菌效果，成本低，可用性高，我们的实验结果证明了乳香提取物对牙周致病菌有较好的抑菌性，这与国外的大部分乳香提取物的抑菌实验结果一致[11，12]，为乳香提取物对牙周致病菌革兰氏阴性菌的抑菌作用研究提供了理论基础。

乳香提取物可能替代口腔局部应用的抗生素，有效抑制牙周致病菌的生长，对慢性牙周炎等多种牙周疾病的治疗可能具有良好的辅助作用。今后我们将对乳香提取物进行深入研究,使其在牙周病的防治中发挥作用。

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Bacteriostasis effect of extract of boswellin on two kinds of periodontal pathogens in vitro

ZHANG Dong-xue,CHENG Cheng,WANG Lei,WANG Ji-tian,JIANG Tong,LIN Mei,WANG Zuo-min(Institution: Beijing ChaoYang Hospital affiliated with Capital Medical University,Deparment of Stomatology,Beijing 100020,China)

Objective:To determine the bacteriostasis effects of Extract of Boswellin on two kinds of periodontal pathogens.Methods:Dilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration(MIC)and minimum bactericidal concentration of extract of Boswellin for Porphyromonas gingivalis(Pg),Fusobacterium nucleatum(Fn).The antimicrobial characters of Extract of Boswellin and 0.2%Gel Gingival hyaluronic acid on the two kinds of pathogens were evaluated by disk diffusion method.Results:The MIC of Boswellin extract on Pg and Fn was 0.325%,and the MBC of Boswellin extract was 0.325%for Pg,and MBC for Fn was 2.5%.Extract of Boswellin showed different antimicrobial effects on the two periodontal pathogens(Pg＞Fn).The best antimicrobial concentration of Extract of Boswellin were 5%. The antimicrobial effect of 10%Extract of Boswellin was better than that of GHA on Pg(P＜0.05).Conclusions:Extract of Boswellin have inhibition effect on Pg and Fn,and the best antibacterial concentration was 5%.The Extract of Boswellin has better antibacterial effect on Pg than Fn.

Extract of Boswellin;Microbial sensitivity tests;periodontal pathogens

R781.4

A

1672-2973(2017)04-0224-04

2017-03-14)

首都医科大学附属北京朝阳医院青年科学基金(编号YQ2015-26)

张冬雪首都医科大学附属北京朝阳医院口腔科医师北京100020

程成北京市核工业医院口腔科医师北京100045

王蕾首都医科大学附属北京朝阳医院口腔科硕士生北京100020

王吉天首都医科大学附属北京朝阳医院口腔科硕士生北京100020

姜彤中国中医科学院望京医院口腔科副主任医师北京100102

林梅首都医科大学附属北京朝阳医院口腔科主治医师北京100020

王左敏通讯作者首都医科大学附属北京朝阳医院口腔科主任医师教授北京100020