李凌汉+何虹+林勇

[摘要] 目的 探討膝骨性关节炎患者不同中医证型患者外周血Th17细胞和相关的细胞因子（IL-17、IL-1β和IL-6）的水平与盘龙七片疗效的关系。 方法 选取淤血阻滞、阳虚寒凝、肾虚髓空三种中医证型患者各25、24和26例，正常对照组24例，患者采用盘龙七片治疗，每日3次，每次3片，治疗前和治疗6周后，留取正常对照组和患者外周血，采用流式细胞术和ELIS法检测Th17细胞和血清细胞因子IL-17、IL-1β和IL-6浓度，并进行疗效评估。 结果 肾虚髓空、阳虚寒凝、瘀血阻滞三种中医证型患者Th17细胞比例和细胞因子浓度均高于正常对照组，且呈现逐渐增高的趋势，差异有统计学意义（P<0.05）；三种中医证型有效治疗者，Th17细胞比例和细胞因子浓度显著降低，差异有统计学有统计学意义（P<0.05）；三种中医证型患者疗效呈现增高的趋势，肾虚髓空型高于另外两种证型，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 膝骨性关节炎患者外周血Th17细胞比例和细胞因子IL-17、IL-1和IL-6浓度与盘龙七片的疗效有关，可作为中医证型和预后的参考指标。

[关键词] 骨关节炎，膝；Th17细胞；白细胞介素-6；IL-1β；盘龙七片

[中图分类号] R593.22 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）13-09-04

[Abstract] Objective To explore the levels of peripheral blood Th17 cells and related cytokines including IL-17，IL-1βand IL-6 for different Traditional Chinese Medicine（TCM）Syndromes of patients with knee osteoarthritis and the relationship between Panlong Seven effect. Methods Knee osteoarthritis patients were divided into symptoms as blood stasis type （n=25），Yang deficiency cold coagulation type （n=24），kidney deficiency type（n=26） three groups.24 healthy persons served as control.All patients were administrated with Panlong Seven tablets，3 times a day，3 tablets each time.Before treatment and 6 weeks after treatment，peripheral blood in normal control group and all patients were collected.Flow cytometry and ELISA were used to detect the Th17 cells and theconcentrations of IL-17，IL-1β and IL-6 in serum，meanwhile to evaluate the therapeutic effect of Panlong Seven. Results The levels of Th17 cells and related cytokines in three TCM syndrome types patients of kidney deficiency type，Yang deficiency cold coagulation，blood stasis were higher compared with the normal control group.There were statistically significant difference（P<0.05）.The levels of them showed a gradually increasing trend.The percentage of Th17 cells and the concentration of cytokines were significantly decreased in effective patients in three TCM syndroms.There were statistically significant difference（P<0.05）.The curative effect showed gradually increasing trend.kidney deficiency type were higher than other two types，and there were statistically significant difference （P<0.05）. Conclusion The effect of Panlong Seven is related to the levels of Th17 cells and cytokines IL-17，IL-1β and IL-6 in peripheral blood of patients with knee osteoarthritis，and they can be used as reference for TCM syndrome and prognosis.

[Key words] Knee osteoarthritis；Th17 cell；Interleukin-6；Interleukin-1β；Panlong seven

骨性关节炎（Osteoarthritis，OA）是全球范围内的常见病、多发病之一，国内研究数据统计表明，55岁以上人群X线显示有OA表现者约60%。随着人口老龄化，发病率在全球范围内呈现出一种逐年上升的趋势。目前尚没有一种根治方法。疼痛和发病的机制与关节滑膜细胞分泌过多的IL-1、IL-6、前列腺素E1并释放入血液有关，关节液中玻璃酸钠的分子量、浓度均降低导致骨关节发炎[1-2]。临床上辩证分型有肝肾亏虚、精血亏虚、瘀血阻滞三种。治则：滋补肝肾、补气活血、化瘀止痛。盘龙七片在治疗膝关节骨性关节炎和类风湿性关节炎临床实践中已经初步显示出较好的疗效和减少副作用[3-6]。本研究就盘龙七片对膝骨性关节炎三种不同的中证型的疗效及其与外周血Th17细胞及其相关细胞因子关系进行研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料

KOA患者共75例，为2013年1月～2014年12月在广州市第一人民医院中医科住院或者门诊的患者，正常对照组为体检健康者。KOA诊断标准参考中华医学会骨科学分会《骨关节炎诊治指南（2007年版）》[7]。患者纳入标准：（1）化脓性膝关节炎的患者；（2）并发病影响到关节者，如骨肿瘤、骨结核或有明显急性外伤史而造成半月板损伤、韧带断裂及血管神经损伤者；（3）膝关节局部有软组织感染者；（4）妊娠或哺乳期妇女，伴有精神病，严重心、肺、肾及内分泌系统疾病的患者。中医诊断标准参照《中西医结合骨伤科学》[8]，KOA分3型：①淤血阻滞；②阳虚寒凝；③肾虚随亏。我们按照上述分型进行分组。KOA的一般临床资料，包括三种中医证型性别、年龄、病程、膝关节病变的部位，以及正常对照组资料，见表1。三组和正常对照的性别和年龄上有可比性，KOA三种中医证型的病程和膝关节病变部位有可比性，见表1。治疗方案：予以口服盘龙七片（陕西盘龙制药有限公司），每次3片，每日3次，饭后温开水送服。治疗后6周进行疗效评估和抽取外周血进行细胞因子和Th17细胞检测。

1.2 疗效评定

疗效标准疗效判定标准参照《中药新药的临床研究指导原则》，疗效判定为治愈、显效、有效和无效，总有效率=（治愈+显效+有效）/总例数×100%[9]。

1.3 Th17细胞和细胞因子的检测

1.3.1 外周血标本采集 正常对照组和患者在治疗前、治疗后6周空腹分别采集外周静脉血标本5Ml，Ficoll-Hypaque 密度梯度离心法分离出单个核细胞（MNC）和血清，血清-30℃冰箱保存。

1.3.2 流式细胞术检测Th17细胞 外周血Th17细胞的流式细胞术的检测方法参照我们的既往检测方法和试剂盒说明[10]。

1.3.3 ELISA法检测IL-17、IL-1β、IL-6浓度 血清IL-17、IL-1β、IL-6 浓度的检测按ELISA 试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学方法

本研究数据采用SPSS16.2统计软件，计量资料以（）表示，采用t检验；多组间均值比较采用单因素方差分析，若方差齐总体均值比较采用F检验，组间均值两两比较采用Student-Newman-Keuls检验，若方差不齐，总体均值比较采用welch检验，组间均值两两比较采用Dunnetts t3检验；治疗前后的比较采用配对t检验，计数资料以率表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三种中医证型患者与正常对照组外周血Th17细胞及细胞因子水平比较

三种中医证型KOA患者在治疗前，外周血Th17细胞比例、细胞因子浓度，三种证型均高于正常对照组（ΔP<0.05），淤血阻滞和阳虚寒冷凝组高于肾虚髓空组（#P<0.05），淤血阻滞组高于阳虚寒冷凝组（*P<0.05）。Th17细胞：肾虚髓空组、阳虚寒冷凝组、阳虚寒冷凝组与对照组比较， q=3.77、3. 89和3.93；阳虚寒冷凝组、淤血阻滞组与肾虚髓空组比较，q=3.70、3.88；淤血阻滞组与阳虚寒冷凝组比较，q=3.71；IL-17：肾虚髓空组、阳虚寒冷凝组、淤血阻滞组与对照组比较，q=4.31、4.62、4.73；阳虚寒冷凝组、淤血阻滞组与肾虚髓空组比较，q=3.72、4.18；淤血阻滞组与阳虚寒冷凝组比较，q=3.78；IL-1β：肾虚髓空组、阳虚寒冷凝组、淤血阻滞组与对照组比较，q=3.77、3.82、3.88；阳虚寒冷凝组、淤血阻滞组与肾虚髓空组比较，q=3.75、3.88；淤血阻滞组与阳虚寒冷凝组比较，q=4.97；IL-6：肾虚髓空组、阳虚寒冷凝组、淤血阻滞组与对照组比较，q=3.79、3.84、4.18；阳虚寒冷凝组、淤血阻滞组与肾虚髓空组比较，q=3.74、3.83；淤血阻滞组与阳虚寒冷凝组比较，q=3.77。见表2。

2.2 三种中医证型患者治疗前后比较

盘龙七片对3种中医证型患者之间的总的疗效有统计学差异（χ2=6.03，P<0.05），有效率呈现逐渐增高的趋势；有效治疗者外周血Th17细胞比例、細胞因子浓度显著降低，差异有统计学意义（P<0.05），而IL-1β在三组的有效治疗前后无统计学意义（P>0.05）。见表3。由于无效者例数少，未做治疗前后比较。

2.3 三种中医证型疗效比较见表4。

3 讨论

膝关节骨关节炎是引起中老年人膝关节疼痛的主要原因，本研究选择年龄45岁以上的患者入组。中医学认为本病属“骨痹”范畴，临床上辩证分型有三种[8]。近年来发现免疫因素在炎症发生发展中起到重要作用，并发现有许多中成药包括盘龙七片在治疗膝关节骨关节炎方面有独到之处。本研究发现，三种证型的患者外周血Th17细胞比例，IL-1β、IL-6和IL-17浓度均高于正常对照组；盘龙七片治疗三种证型有效者，Th17细胞比例、IL-1β、IL-6和IL-17浓度均显著降低，表明治疗有效者通过抑制了Th17细胞的分化，减少Th17细胞分泌IL-17有关。

KOA的治疗原则为：滋补肝肾、补气活血、化瘀止痛，在临床实践中盘龙七片不失为治疗骨痹的有效药物，且与其降低患者外周血中IL-6和IL-17和IL-1β水平有关[3]。

众所周知，IL-1β和IL-6及TNF-α与Th17细胞的分化发育和释放的细胞因子密切相关，且Th1和Th17细胞通常在细胞免疫中相互作用，相互制约。最近研究表明Th17细胞在炎症性疾病和自身免疫性疾病中起到一定作用[11]，透明质酸钠注射液联合塞来昔布胶囊降低膝骨关节炎患者血清IL-1β、TNF-α水平，与临床疗效相关[12]。本研究的盘龙欺骗对Th17细胞及细胞因子的作用，更加说明了膝关节骨关节炎的发展与炎症反应有关。

RA和OA是滑膜炎为特征的慢性炎症性疾病，人类滑膜组织中存在大量纤维母细胞样滑膜细胞（ FLS），而在慢性关节炎的致病作用中起到主要的作用，FLS被TLR配体、炎症因子，协调作用激活FLS，导致FLS损害关节的作用[13]。本组研究发现三组患者外周血中IL-6和IL-1β、IL-17高于正常对照组。KOA患者主要是IL-6、IL-1β浓度的增加促进Th17细胞的分化，而Th17细胞分泌特征性的细胞因子IL-17进一步加重KOA发展。而对于中医三种证型患者IL-17浓度有显著性差异，表明IL-17在不同证型中的作用不同 [14]。我们在此基础上进一步研究，发现与此相对应的三种证型的患者外周血Th17细胞的差异与IL-17差异相一致，治疗有效者，Th17细胞比例、细胞因子浓度显著降低，有可能作为预后的指标之一。

本研究表明，外周血Th17、血清细胞因子含量在KOA各型中不同，瘀血阻滞型最高，阳虚寒凝型次之，肾虚髓空型最低，各型之间存在显著性差异，说明肾虚髓亏型KOA多发生在早期阶段，病情较轻；阳虚寒凝型KOA多发生在中期阶段，病情相对较重；血瘀阻滞型则多发生在晚期阶段，病情程度严重[15]。在盘龙七片治疗中，发现淤血阻滞、阳虚寒冷凝和肾虚髓空型的总有效率呈现逐渐上升的趋势，且肾虚髓空型的疗效显著高于其他两组，这可能与三种证型处于疾病发展不同阶段有关，在临床上提升若患者处于较晚期阶段可以采用联合用药或物理治疗等综合治疗，可望提高疗效[5]。

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（收稿日期：2017-05-09）