陈翔，张佳琦，汪泽，许旭，朱滨

荧光定量法测定DNA熔解温度

陈翔，张佳琦，汪泽，许旭，朱滨

DNA 熔解温度（Tm）指 DNA 双链变性过程中一半双链解离为单链的温度[1]，是 DNA 片段的一个重要特性。准确测定 DNA 片段 Tm值，是分子生物学实验方法（如PCR 检测技术、核酸杂交检测技术等）建立的基础，在疾病的分子诊断领域具有重要现实意义[2-4]。影响 DNA 片段Tm值的因素有很多，如 DNA 片段的长度、DNA 片段的GC% 含量[5]、盐离子浓度、pH 等[6]。传统测定 DNA 片段 Tm值的方法多用紫外分光光度法[7-9]，该方法有一定的局限性，溶液需要量大，操作起来不方便。利用荧光试剂（如 SYBR Green I）与双链 DNA 结合后荧光大大增强的特点，采用荧光定量法可以较好解决这些问题。用荧光定量法测定 DNA 样品在含有 SYBR Green I 溶液中的熔解曲线，根据其导数曲线熔解峰对应的温度可以确定 DNA 样品的 Tm值。荧光定量 PCR 仪溶液需求量小，不需太多操作，能很好地控制反应的温度，进行实时自动化检测[10-11]。本文用荧光定量法测定不同大小、不同 GC% 含量 DNA片段的 Tm值并研究了其影响因素，显示该法可用于实际样品测定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

FQD-48A 型荧光定量 PCR仪、TC-XP-D 型 XP 基因扩增仪、HB-100 型恒温金属浴为杭州博日科技有限公司产品；Cary 100 型紫外可见分光光度计为美国安捷伦科技有限公司产品；OD-1000+ 超微量分光光度计为南京五义科技有限公司产品。

SYBR Green I（10 000 ×）购自厦门致善生物科技股份有限公司；lambda DNA、DMSO、Tris 盐酸盐、Tris 碱均为生工生物工程（上海）股份有限公司产品；K2HPO4·3H2O、KH2PO4均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 不同大小、不同 GC% 含量 DNA 片段的制备 大片段 DNA 的 GC% 含量大多没有显著差异，选择商业化lambda DNA 产品。150～300 bp 的不同 GC% 含量 DNA片段的制备是选择人基因组中不同 GC% 含量的基因（TPMT、CY、APOE），采用体外扩增并纯化。25 bp 的不同 GC% 含量 DNA 片段（Oligo A、Oligo B、Oligo C）委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成并纯化。不同GC% 含量的 DNA 序列见表 1。

1.2.2 溶液的配制

⑴荧光染色剂稀释液：规格为 10 000 × 的 SYBR Green I 溶液用 DMSO 稀释 10 000 倍，备用。

表1 不同 GC% 含量的 DNA 序列

⑵磷酸盐缓冲液：称取 K2HPO4·3H2O 和 KH2PO4，分别配制成 50 mmol/L 的溶液，两种磷酸盐溶液调节 pH 至7.4 左右，备用。

⑶Tris 盐缓冲液：称取 Tris 盐酸盐和 Tris 碱，分别配制成 400 mmol/L 的溶液，两种 Tris 溶液调节 pH 至7.4 左右，备用。

1.2.3 荧光测定 DNA 片段 Tm取荧光染色剂稀释液1 μl、磷酸盐溶液 4 μl（终浓度5 mmol/L）、Tris 盐溶液 6 μl（终浓度 60 mmol/L），加入适量 DNA 溶液（使定量后DNA 终浓度为 10 ng/μl），用超纯水定量至 40 μl。配制好的溶液放入荧光定量 PCR 仪中，设置程序为：30 ℃、30 s，65 个循环，每个循环增加 1 ℃。测定 DNA 片段的熔解曲线，得到熔解导数曲线，取熔解导数曲线的峰对应的温度为Tm值。

1.2.4 紫外测定 DNA 片段 Tm磷酸盐溶液（终浓度5 mmol/L）、Tris 盐溶液（终浓度 60 mmol/L），加入适量DNA 溶液（使定量后 DNA 终浓度为 10 ng/μl）。紫外分光光度计设置固定吸收波长 260 nm，升温速率 1 ℃/min，升温范围 30～95 ℃。得到 DNA片段随温度升高的紫外吸收曲线，取紫外吸收过渡曲线的中点对应的温度为 Tm值。

2 结果

2.1 不同 DNA 片段的 Tm值

不同大小、不同 GC% 含量 DNA 片段的 Tm值见表 2。本实验条件下，荧光法可测定不同 GC% 含量各种大小 DNA 片段的 Tm值，仅在寡核苷酸小片段的 GC%含量过高时（Tm大于 90 ℃，接近水的沸点），荧光定量法与紫外法一样均难以准确测定，而紫外法在测定小片段DNA 的 Tm值时还需要显著提高 DNA 浓度。荧光法与紫外法测定值基本一致，CY 片段荧光熔解曲线如图 1 所示，荧光熔解导数曲线图如图 2 所示。

表2 不同 DNA 片段的熔解温度（Tm）值

图1 CY 片段荧光熔解曲线

2.2 荧光定量法测定 Tm值时荧光染料与 DNA 的浓度配比

实验表明，对于不同大小、不同 GC% 含量的 DNA 片段，用荧光定量法测定 Tm值时，SYBR Green I 适宜的终浓度为 0.025 ×。在上述荧光染料浓度条件下，DNA 片段的适宜终浓度取决于 DNA 片段的大小，片段越小，终浓度越大。在本文建立的实验条件下，大片段 DNA（kb 级）适宜终浓度不低于 5 ng/μl，中等大小 DNA（数百 bp）适宜终浓度不低于 10 ng/μl，小片段（数十 bp）适宜终浓度不低于 20 ng/μl。同等大小的 DNA 片段，GC% 含量越高，适宜浓度也越高。例如，TPMT 片段浓度低至 1 ng/μl 时，可见明显荧光导数曲线峰，而 APOE 片段浓度为 5 ng/μl时，荧光导数曲线峰才可见。

用荧光定量法测定 DNA 片段的 Tm值时，DNA 浓度、SYBR Green I 染料量均不宜过高，否则荧光导数曲线图会出现异常峰（馒头峰或双峰），给 Tm值的确定带来困难。这可能是 DNA 解链会引起荧光信号变化产生，而解链后的 DNA 自身折叠形成局部双链（高浓度时更明显）解链也会引起荧光信号的变化，各因素叠加后使峰形复杂。

2.3 缓冲体系对测定的影响

图2 CY 片段荧光熔解导数曲线

图3 TPMT 片段荧光熔解导数曲线（1：Tris 盐浓度5 mmol/L；2：Tris 盐浓度 30 mmol/L；3：Tris 盐浓度60 mmol/L）

盐浓度的变化会对 DNA 片段 Tm值产生显著影响。通常采用磷酸盐缓冲体系，以保持测定过程中盐浓度、pH的稳定。荧光导数图的峰形会受缓冲体系的影响，在缓冲体系中增加 Tris 盐浓度会明显改善低 GC% 含量 DNA 片段荧光导数曲线峰形（图 3），对 Tm值略有提高，影响不大。DNA 片段 GC% 含量越高，上述改善越不明显，但会明显提高 Tm值。

3 讨论

荧光定量 PCR 仪由于样品量小（微升级）、温控准确、功能强大、自动化程度高迅速在临床及科研领域得到普及。除了聚合酶链反应等常规用途，用于 DNA 片段 Tm值研究与传统的紫外分光光度法相比，优势明显。

紫外分光光度法测定 DNA 熔解曲线原理是单链DNA 的吸光度大于双链，根据吸光度的变化来确定 DNA熔解曲线，实际操作中，影响因素较多。DNA 溶液若不纯，其紫外吸收曲线会出现不利于判定 Tm值的情况。紫外法测定互补寡核苷酸小片段，寡核苷酸小片段原本即为两条单链，有一定的吸光度，浓度过低，熔解曲线会呈现一条逐渐升高的直线，无法判定 Tm值。

荧光定量法测定 DNA 的 Tm值是基于特殊的荧光染料分子（EB、SYBR Green I、吖啶橙等），这些染料分子可以插入双链 DNA 分子中，插入前后荧光染料分子的荧光强度有数十倍的差异。同样插入双链 DNA 中的荧光染料分子的荧光强度随 DNA 分子的解链也会产生显著变化。DNA 溶液纯度和片段大小对该法影响较小。荧光染料的用量以产生适宜的荧光强度变化为宜。目前已有专门用于此的商业试剂盒可供选择。

采用荧光定量法测定 DNA 片段 Tm值，荧光染料与DNA 的浓度配比非常重要。由于荧光染料分子插入 DNA片段后复合物本身的荧光强度会随着温度升高而下降，配比不合适会掩盖 DNA 解链引起的荧光强度下降。也因为该原因，用荧光导数图将更直观、更准确。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.04.014

上海张江国家自主创新示范区专项发展资金重点项目（201609-XH-CHJ-C1085-003）

201418 上海应用技术大学化学与环境工程学院（陈翔、许旭）；200233 上海百傲科技股份有限公司（张佳琦、汪泽、朱滨）

朱滨，Email：zhubin@baio.com

2017-05-01