秦曙光，田红燕，张军波，孟 燕

（1西安交通大学第二附属医院心内科，西安710004；2西安交通大学第一附属医院心内科，西安710004）

·论著·

纤维蛋白原Bβ455G/A基因多态性与深静脉血栓形成的相关性

秦曙光1，田红燕2，张军波2，孟 燕2

（1西安交通大学第二附属医院心内科，西安710004；2西安交通大学第一附属医院心内科，西安710004）

目的 通过检测深静脉血栓形成（deep vein thrombosis，DVT）患者纤维蛋白原（fibrinogen，Fg）Bβ-455G/A基因，分析其基因多态性与DVT的相关性。方法利用聚合酶链反应限制性片段长度多态性对2014年1月至2016年1月在西安交通大学附属医院收治的、已确诊为DVT的100例住院患者和同期门诊体检的100名健康人员，进行FgBβ-455G/A基因型分析，并比较两组血浆Fg浓度。结果DVT组FgBβ-455G/A基因多态性频率及构成比明显高于正常对照组，差异有统计学意义；DVT组Fg浓度明显高于正常对照组，差异有统计学意义［（3.85±1.44）g/Lvs.（2.80±0.71）g/L，P＜0.01］。方差分析结果示每种FgBβ455G/A基因型之间血浆中Fg浓度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论FgBβ455G/A基因多态性与DVT无明显相关性。

深静脉血栓形成；纤维蛋白原；基因多态性

深静脉血栓形成（deep vein thrombosis，DVT）是一类致残率及病死率均较高的血栓性疾病，其病因复杂，发生机制亦尚未明确［15］。纤维蛋白原（fibrinogen，Fg）是重要的凝血因子，在凝血、血小板聚集、纤溶调节、动脉硬化的发生及发展等诸多方面起着重要的作用。近年来，已见报道10多个Fgβ基因多态性位点，但这些基因多态性是否对血浆Fg浓度及血栓性疾病有影响却存在争议［6］。文献报道FgBβ455G/AmRNA的合成是整个Fg分子合成的限速步骤［7］。大多研究表明，FgBβ-455G/A基因多态性与动脉血栓性疾病具有密切相关性，但是对于FgBβ455G/A基因多态性与静脉血栓类疾病的关系还知之甚少。本研究将对比分析DVT患者及健康对照者FgBβ455G/A基因多态性，探讨DVT患者FgBβ455G/A基因多态性与DVT的相关性，为DVT易感人群的防治提供可能的理论依据。

1资料和方法

1.1一般资料

选择2014年1月至2016年1月在西安交通大学附属医院住院的急性期、亚急性期DVT患者（即发病1个月内）100例作为病例组，其中男47例，女53例，年龄（53.11±14.6）岁，以4070岁年龄段为发病高峰（占总DVT人数的72%）。纳入标准：（1）DVT经过下肢深静脉造影证实；（2）发病≤30 d；（3）病变部位为单侧或双侧下肢；（4）肺血栓栓塞症（pulmonary thromboembolism，PTE）及下腔静脉血栓形均经过肺动脉造影确诊；（5）诊断符合2008年中华医学会外科学分会血管外科学组制定的诊断标准［8］。选取同期门诊体检的100名健康人员为对照组，其中男55例，女45例，年龄（49.20±13.6）岁。纳入标准：（1）肺、心、腹常规体检及血液生化检查无明显异常；（2）无血栓类病史；（3）无心、脑、肝、肾等重要脏器疾病；（4）无血液、肿瘤、风湿类风湿疾病；（5）近期无感染手术外伤史；（6）Wells临床评分［9］＜1。两组研究对象在年龄、性别构成、体质量指数上比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。所有入组人员均为久居西安市区及周边地区的汉族人，无血缘关系，且签署知情同意书，并得到我院医学伦理委员会的批准。

1.2研究方法

1.2.1标本收集用3.8%构椽酸钠抗凝，按照1∶9的比例抽取外周静脉血6 mL，3 000 r/min离心，收集血浆于我院检验科应用大型血浆分析仪利用凝固法检测血浆Fg浓度。

1.2.2抽提基因组DNA采用上海天根公司人全血DNA提取盒提取；样本组DNA浓度均＞50 ng/μL，纯度为1.751.90 μg/μL。

1.2.3聚合酶链反应扩增引物的设计与合成：利用软件PR IM ER 5.0和Hooft等［10］设计引物，委托北京三博远志生物技术有限公司合成。两个基因位点的引物：上游引物序列为AAGAATTT GGGAATGCAATCTCTGCTACCT，下游引物序列为CTCCTCATTGTCGTTGACACCTTGGGAC。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）反应体系总体积 50 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL；DNA模板（500 ng/2 μL）2 μL；水21 μL。PCR扩增反应条件：93℃ 预变性 5 min；93℃ 变性 1 min；55℃退火1 min；72℃延伸2 min；共经35个循环；72℃再次延伸5 min。

1.2.4限制性片段长度多态性酶切反应体系共51 μL：PCR15 μL；Hea III10 U；Buffer 5 μL；水21 μL。上述成分混合后37℃酶切4 h；取10 μL酶切产物上1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.2.5电泳分析方法限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）电泳：酶切产物10 μL、10×Loading Buffer1 μL电泳，100 V电压电泳20 min，溴化乙锭（EB）染色，紫外凝胶观察并照相。

1.3统计学分析

采用SPSS 16.0软件分析处理数据。基因频率采用基因记数法，基因型和等位基因频率比较采用卡方检验。计量资料经方差齐性检验后，以（）表示，采用t检验。所有统计检验均采用双侧概率检验（α=0.05），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1两组纤维蛋白原浓度比较

DVT组Fg浓度明显高于对照组，差异有统计学意义［（3.85±1.44）g/Lvs.（2.80±0.71）g/L，P＜0.01］。

2.2纤维蛋白原Bβ455G/A基因多态性酶切结果

将所有DNA样本（共计200份）进行PCR扩增后得到一个1 300 bp的片段，有两处HeaIII酶的酶切位点，电泳后发现3组酶切产物：AA型、AG型、GG型。AA型：酶切后有343 bp、958 bp两条带；AG型：酶切后有343 bp、383 bp、575 bp、95 bp共4条带；GG型：酶切后有343 bp、383 bp、575 bp共3条带；酶切电泳如图1。

图1 FgBβ-455G/A酶切电泳结果图

2.3纤维蛋白原Bβ455G/A基因的HardyWeinberg遗传平衡检验

DVT组AA、A/G、GG实际例数分别为11、48、41；A等位基因频率为35%，G等位基因频率为65%。对照组AA、A/G、GG实际例数分别为8、33、59；A等位基因频率为24.5%，G等位基因频率为75.5%。DVT组AA、A/G、GG预期频率为12.25%、45.5%、42.25%；预期例数为12、46、42例。对照组中AA、A/G、GG预期频率为6%、37%、57%；预期例数为6、37、57例。DVT组与对照组观察值与期望值比较，差异无统计学意义（P＞0.05），符合HardyWeinberg遗传平衡检验，提示本组研究样本具有群体代表性。

2.4纤维蛋白原Bβ455G/A基因频率分布的分析结果

DVT组FgBβ455位点A等位基因分布频率高于对照组；两组FgBβ455G/A基因型频率构成、A等位基因及G等位基因频率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表1。

表1 DVT组与对照组FgBβ-455G/A基因型分布比较 ［n（%）］

2.5纤维蛋白原Bβ455G/A基因多态性与血浆中纤维蛋白原浓度的关系

FgBβ455G/A基因型为AA的观察者血浆中Fg浓度为（3.78±1.52）g/L，基因型为AG的观察者血浆中Fg浓度为（3.37±1.12）g/L，基因型为GG的观察者血浆中Fg浓度为（3.19±1.28）g/L。方差分析结果示每种基因型之间血浆中Fg浓度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；且每两种基因型之间血浆Fg浓度比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具体如表2。

表2 不同FgBβ-455G/A基因多态性间Fg浓度比较［g/L，±s］

表2 不同FgBβ-455G/A基因多态性间Fg浓度比较［g/L，±s］

基因多态性AA AG GG n 11 48 41 Fg浓度3.78±1.52 3.37±1.12 3.19±1.28 P值0.193 0.339 0.059

3讨论

本研究DVT患者共100例，其中混合型DVT共73例，构成比明显高于其他类型DVT，此构成比与国内多数研究相类似。本研究中，DVT组Fg浓度明显高于对照组，认为血浆Fg浓度升高可能参与了血栓事件的发生；结论同IIIRaga［11］相类似，认为血浆Fg浓度的升高可能会增加静脉血栓风险。考虑血栓事件风险的增加可能和Fg通过与血小板、红细胞的相互作用，增高血液黏度；同时促发内、外源凝血系统并降低纤溶活性有关［12］。

本研究DVT组及对照组基因型符合Hardy-Weinberg遗传平衡检验，说明样本具有一定的群体代表性；其中DVT组中AA及AG基因分布较对照组明显升高，与吕柏楠等［13］研究认为AA基因、A等位基因与DVT形成的独立危险因素的结论相类似。其原因可能与Bβ455位点G基因突变为A基因，Fg分子结构功能异常，机体凝血纤溶系统病理改变有关，使DVT风险增加。

本研究结果显示，FgBβ455G/A基因型AA、AG、GG患者Fg浓度比较，差异无统计学意义（P＞0.05），结论同张秀华等［14］报道相类似。然而，尚不能得出血浆FgBβ455G/A基因型AA、AG频率与血浆Fg浓度具有相关性的结论，与Thomas和Kessler等［1516］研究报道结果类似。而Leiden的血栓形成倾向研究中报道Bβ-455A基因和静脉血栓逆关联，并且其基因型和血浆Fg浓度也没有相关性。

综合这些研究推测：FgBβ455G/A基因的突变可能与其他致病基因相关联，而其本身并非血栓事件的致病基因；也可能通过这一基因的突变，使Fg凝血功能随之变化，致使血栓事件风险增大，而并非通过升高其血浆浓度；与陈永玲等［17］DVT相关因子基因多态性相关研究结果类似。

综上所述，Fg基因多态性发生频率升高对增加血栓事件风险的进一步证实，也是对机体凝血机制的扩充。但由于不同基因位点的作用机制不尽相同、基因之间交联作用、相同位点的研究结果存在差异。考虑到人种、遗传、地域的差别以及生活环境等多方面因素的影响，要求我们在研究时应针对不同地域的人群进行独立分析，并扩大样本量，综合分析各因素间的相互作用来得出客观并且准确的结论。Fg基因多态性及DVT的深入研究，有助于我们进一步识别DVT的高危人群，对静脉血栓性疾病进行一级预防、指导用药和预后评估。相信随着对Fg基因多态性研究的不断深入，以及对DVT认识的逐步提高，必将改善其预防及治疗的水平。

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Correlation between fibrinogen B β-455G/A polymorphism and deep vein thrombosis

QIN Shuguang1，TIAN Hong-yan2，ZHANG Junbo2，MENG Yan2
（1Department of Cardiology，The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710004，China；2Department of Cardiology，The First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China）

ObjectivesTo investigate the association between polymorphism of fibrinogen gene（Fg）Bβ455G/A and deep venous thrombosis（DVT）by detecting the Fgβ455G/A gene of patients with DVT.MethodsFrom January 2014 to January 2016，100 hospital patients with DVT were selected to case group，at the same time，100 volunteers who were healthy during health examination in The Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University constituted control groupAfter blood collection，the two groups were measured plasma concentration of Fg and then detected the FgB β455G/A polymor⁃phism by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism（PCRRFLP）ResultsPlasma con centration of Fg in case group was higher than that in control group［（3.85±1.44）g/Lvs.（2.80±0.71）g/L，P＜0.01］；FgBβ-455G/A genotypes and alleles frequency were higher in case group than the ones in control group（P＜0.05）Variance analysis indicated that plasma concentration of Fg among different FgBβ455G/A genotypes had no significant differences（P＞0.05）ConclusionFgBβ-455G/A gene polymorphism and DVT has no obvious correlation

deep venous thrombosis；fibrinogen；gene polymorphism

R543.6

A

10079688（2017）04043504

20160224）

10.3969/j.issn.1007-9688.2017.04.19

秦曙光（1984），女，主治医师，研究方向为心血管疾病的发病机理与临床综合治疗。