陈强赵翠娟

JNK抑制剂对烧伤后大鼠肠黏膜损伤的影响

陈强1赵翠娟2

目的探讨JNK抑制剂对烧伤后大鼠肠黏膜损伤的干预作用及其可能的机制。方法将72只SD大鼠，分为正常对照（C）组8只，烧伤对照（B）组32只，烧伤+SP600125干预（A）组32只。A组与B组给予90℃水烫伤7S，造成30%体表面积Ⅲ度烧伤。A组于烧伤前2小时腹腔注射SP600125，剂量20 mg/kg。A组、B组烧伤后第1天、第3天、第5天、第7天各组分别处死大鼠8只，C组大鼠实验后第2天处死。采用HE染色法观察烧伤后大鼠回肠组织形态学变化；通过流式细胞仪检测大鼠回肠凋亡率的变化；采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测大鼠回肠中细胞因子IL-6和TNF-a的含量；免疫组织化学染色检测p-JNK表达。结果与B组相比，A组各时相点回肠黏膜凋亡率均减少，IL-6和TNF-a含量降低，p-JNK表达减少，差异有统计学意义（P＜0．05）。结论通过抑制p-JNK表达，可以减少烧伤模型大鼠回肠黏膜组织细胞凋亡，降低炎性介质IL-6和TNF-a含量，从而减轻黏膜组织损伤。

烧伤；c-Jun氨基末端激酶；凋亡；炎症介质

肠道黏膜屏障是机体正常防御的重要屏障，在肠源性感染的发生发展过程中发挥重要作用[1]。研究表明严重创伤、烧伤、休克、出血等均可导致肠功能障碍、肠内细菌及毒素移位，进一步加重原发疾病，诱发多器官功能障碍及其他重要并发症的发生，这与肠道黏膜上皮损伤、免疫功能紊乱及肠道菌群失调有关[2]。

c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）被磷酸化后可以使许多参与炎症反应的细胞因子的基因表达，且在调解Thl/Th2免疫细胞的分化中的起到重要作用，并且参与细胞凋亡[3]；本研究采用JNK选择性抑制剂SP600125抑制JNK的活化，并检测大鼠回肠黏膜内的P-JNK、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素-6（interferon-6，IL-6）以及肠道黏膜上皮细胞凋亡的改变情况，探讨SP600125对烧伤后大鼠肠黏膜损伤的干预作用及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SD大白鼠72只，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号：SCXK（京）2012-0001。

1.2 实验仪器和试剂

流式细胞仪来自内蒙古医学院第三附属医院；IL-6和TNF-a的ELISA试剂盒、p-JNK抗体、SP600125及其他试剂均购自福州迈新公司。

1.3 大鼠烫伤模型的制作及分组

健康SD大鼠72只，雌雄不分，体质量（180±20）g。实验室标准动物管理及饲养条件，定时供食，自由饮水饲养1周后试验，随机分为正常对照（C）组8只，烧伤对照（B）组32只，烧伤+SP600125干预组（A）组32只。C组只给予麻醉和剃毛，不予烧伤。A组与B组给予90℃水烫伤7s，造成30%体表面积Ⅲ度烧伤。伤后各组均给予正常饮食及饮水；干预组（A）于烧伤前2小时腹腔注射SP600125，剂量20 mg/kg，SP600125溶解于二甲亚讽（DMSO）中；B组及C组腹腔注射等体积二甲亚讽。B组及A组烧伤后第1天、第3天、第5天、第7天各组分别处死大鼠8只，C组大鼠实验后第2天处死。

1.4 实验观察

采用HE染色法观察A、B组烧伤后1天、第3天、第5天、第7天及C组的大鼠回肠组织形态学变化；通过流式细胞仪检测A、B组烧伤后1天、第3天、第5天、第7天及C组大鼠回肠凋亡率的变化；采用酶联免疫吸附（ELISA）法检A、B组测烧伤后1天、第3天、第5天、第7天及C组大鼠回肠中细胞因子IL-6和TNF-a的含量；大鼠回肠组织标本制作冰冻切片， 进行p-JNK免疫组织化学染色，用JD801形态学显微图像分析系统计算灰度值（IA），IA越高则表示其表达水平越低。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 病理组织学

C组大鼠各时相点肠黏膜结构完整、细胞排列整齐；与C组比较，B组和A组伤后第1天出现不同程度肠黏膜水肿、毛细血管充血，绒毛缩短。伤后第7天，各组肠黏膜组织比较差异最大，B组出现黏膜绒毛坏死、脱落，淋巴细胞、中性粒细胞浸润，肠黏膜局部腺体减少，黏膜下明显充血水肿；与B组比较，A组损伤不同程度减轻，主要表现为绒毛肿胀、黏膜充血水肿，毛细血管充血。

2.2 大鼠回肠黏膜凋亡

与C组相比，A组及B组回肠黏膜凋亡率均增加，第7天最高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与B组相比，A组各时相点回肠黏膜凋亡率均减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.3 大鼠回肠黏膜IL-6、TNF-a表达

与C组相比，A组及B组大鼠回肠黏膜分泌IL-6、TNF-a的量均增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与B组相比，A组各时相点回肠黏膜分泌的IL-6、TNF-a量在伤后均下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.4 大鼠回肠黏膜p-JNK的表达

与C组相比，A组及B组回肠黏膜p-JNK的表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与B组相比，干预组各时相点p-JNK均减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

3 讨论

严重烧伤后可导致胃肠道黏膜损伤，肠道菌群失调，细菌移位，侵入而播散全身发生“肠源性感染”，甚至可导致全身炎症反应综合征（SIRS）和多器官功能障碍（MODS），因而保护烧伤后肠道屏障是烧伤治疗整个过程的一个重要环节[4]。其中主要的机制包括，严重烧伤患者发生应激反应后全身重要脏器血液重新分布，导致胃肠道黏膜严重缺血、缺氧，可引起肠黏膜萎缩凋亡，肠道黏膜机械屏障遭到破坏，细菌和内毒素可直接进入肠系膜淋巴结或血液循环并向全身播散[5]；肠道免疫系统功能低下，促炎症反应及抗炎症反应调节的失衡，导致炎症介质释放导致中性粒细胞过度活化，加重内皮细胞损伤；所以，在烧伤动物模型中大量炎症介质如IL-1α，TNF-α、IFN-γ、IL-6分泌增高[6]。肠黏膜屏障是机体防御肠道有害刺激的第一道防线，肠组织损伤后主要表现为炎症反应和细胞凋亡两方面。在本实验中，严重烧伤大鼠回肠黏膜绒毛坏死、脱落，炎症细胞浸润，局部腺体减少，黏膜下明显充血水肿，同时回肠黏膜凋亡明显增加（P＜0.05），并且与正常对照组相比，回肠黏膜分泌IL-6、TNF-a的量增加（P＜0.05）。

c-Jun氨基末端激酶（JNK）属于丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）家族成员之一，在应激、损伤、炎症因子和氧自由基等刺激条件下而被活化，直接或间接通过激活转录因子AP-1家族的Jun和Fos等，促进相关基因的表达和蛋白质的合成，从而在调节细胞凋亡、分化和增殖、组织炎症反应等病理生理过程中起到重要作用[7]。实验研究发现，JNK参与多种疾病及病理过程，如炎症性肠病、肠缺血再灌注损伤等[8-9]。本实验结果显示，与正常对照组相比，严重烧伤大鼠回肠黏膜p-JNK的表达明显增加（P＜0.05），给予JNK选择性抑制剂SP600125抑制JNK的活化后，可以减少肠黏膜萎缩凋亡，减少炎症介质IL-6、TNF-a分泌，同时明显改善烧伤大鼠回肠黏膜病理损伤（P＜0.05）。

4 结论

本实验初步说明JNK活化在严重烧伤大鼠模型肠道黏膜损伤中的作用，抑制JNK活化后通过抑制肠黏膜凋亡及促炎症因子的释放，从而减轻严重烧伤后肠道黏膜损伤及肠道屏障功能破坏，抑制JNK活化可以作为预防肠道黏膜损伤的治疗靶点。

表1 各组大鼠实验后的回肠黏膜凋亡率、IL-6、TNF-a 及p-JNK的表达比较

[1]卢书明，刘丽娜． 重视肠黏膜屏障功能障碍的防治[J]． 医学与哲学：临床决策论坛版，2011，32（5）：48-49，74．

[2]Clark JA，Coopersmith CM． Intestinal crosstalk： a new paradigm for understanding the gut as the “motor” of critical illness[J]． Shock，2007，28（4）：384-393．

[3]Chenxi Wu，Changyan Chen，Jianli Dai，et al． Toll pathway modulates TNF-induced JNK-dependent cell death inDrosophila[J]．Open Biol，2015，5（7）：140171．

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[5]Deitch EA． Gutoriginsepsis：evolution of a concept[J]． Surgeon，2012，10（6）：350-356．

[6]孙超，李毅，王洪瑾． 硫化氢对烧伤大鼠肠道组织干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α含量的影响[J]． 中华损伤与修复杂志：电子版，2013，8（2）：22-25．

[7]Weston CR，Davis RJ． The JNK signal transduction pathway[J]．CurrOpin Cell Biol，2007，19（2）：142-149．

[8]Kiran Assi，Rex Pillai，Antonio Gómez-Muñoz，et al． The specific JNK inhibitor SP600125 targetstumour necrosis factor-Aproduction and epithelial cell apoptosisin acute murine colitis[J]．Immunology，2006，118（1）：112-121．

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Effect of the JNK Inhibitor on the Mucosal Injury of Rats After Burns

CHEN Qiang1ZHAO Cuijuan21 Department of Burn Surgery, Baogang Hospital, Baotou Inner Mongolia 014010, China; 2 Department of Gastroenterology

burns; c-Jun amino terminal kinase; apoptosis; infammatory mediators

intraperitoneal injection of SP600125 2 hours before burn, with a dose of 20 mg/kg. Rats in group A and group B were sacrificed first days, third days, fifth days and seventh days respectively. 8 rats were killed in each group, and C rats were sacrificed second days after the experiment. HE staining method was used to observe the morphological changes of the ileum in rats after burn; The apoptosis rate of ileum in rats was measured by flow cytometry; Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the levels of cytokines IL-6 and TNF-a in the ileum of rats; Immunohistochemical staining was used to detect the expression of p-JNK.ResultsCompared with group B, the apoptotic rate of ileum mucosa in A group was decreased, the content of IL-6 and TNF-a decreased, and the expression of p-JNK decreased, the difference was statistically signifcant (P＜0.05).ConclusionBy inhibiting the expression of p-JNK, it can reduce the apoptosis of the ileum mucosa tissue and reduce the content of inflammatory mediators IL-6 and TNF-a in the burn model rats, thereby reducing the damage of mucosal tissue.

1内蒙古包钢医院烧伤外科，内蒙古 包头 014010；2消化内科

陈强

R11

A

1674-9308（2017）16-0208-03

10．3969/j．issn．1674-9308．2017．16．113

[Abstract]ObjectiveTo investigate the intervention effect of JNK inhibitors on intestinal mucosa injury in rats after burn and its possible mechanism.Methods72 SD rats were divided into normal control (C) group 8, burn control (B) group 32, and burn +SP600125 intervention (A) group 32. A group and B group were treated with 90 degree water burn 7S, resulting in 30% surface area, third degree burns. Group A