刘红英+金腾飞+戴大响+焦明儒+黄成+张名镇+顾春川

摘 要 采用水热法制备了含有活性铜的碳点，利用荧光光谱和紫外可见吸收光谱对其光学性质进行了表征。通过电沉积法将其修饰于玻碳电极表面， 构建了电化学生物传感器，采用循环伏安法、交流阻抗法和差分脉冲伏安法对电极的电化学行为进行了考察， 并对其电化学反应机理进行了探讨。结果表明，此传感器对尿酸具有良好的电催化效果，可有效消除抗坏血酸和多巴胺等物质的干扰。在最佳条件下，氧化峰电流与尿酸的浓度在1.00～300 μmol/L范围内呈良好的线性关系， 检出限为0.30 μmol/L（S/N=3）。此传感器具有制作简单、选择性好、灵敏度高和线性范围宽等优点，有望应用于实际样品的检测。

关键词 活性铜； 碳点； 电化学； 生物传感器； 尿酸

1 引 言

尿酸（UA）是人体嘌呤的代谢产物[1]，在体内含量过高会导致痛风性关节炎、高尿酸血症和Lesh Nyan综合症等疾病[2]。近年来，随着生活水平提高，越来越多的人处于尿酸过高的亚健康甚至疾病状态。由此可见，UA浓度的准确检测在临床医学领域具有重要意义。发展灵敏、快速、低廉的UA检测方法非常重要。

目前，UA的测定方法有色谱法[3]、分光光度法[4]、荧光法[5]、化学发光法[6]、电化学发光法[7]、电化学法[8，9]等。其中，电化学方法具有选择性好、灵敏度高、操作简单和成本低廉等优点而广泛应用于UA的测定[10]。然而，传统电极上其氧化电位与抗坏血酸（AA）的电位接近，容易受到AA的影响[11]。为了解决这一问题，已发展很多策略。Hiroaki等[12]报道了一种铜修饰电极选择性检测UA。Cu可与UA形成配合物，沉积在电极表面，将AA与UA很好地区分。另一方面，纳米材料具有独特的光学与电学性质以及比表面积大、反应活性高、吸附能力强等优良特性，为电极的表面修饰提供了新的研究途径[13]。

碳点是尺寸小于10.0 nm的纳米颗粒，是近年发展起来的一类新型“零维”碳纳米材料。由于其具有优良的光学性质、良好的生物相容性、化学惰性及低毒性，引起了研究者的关注，成为材料科学前沿领域的一个新研究热点[14]。在过去的几年里，碳点的研究已经取得许多重要成果，在生物成像[15]、药物输送[16]、传感器[17]及能量转换[18]等领域得到很大发展。最近，Ren等利用水热法合成了具有类酶性质的含有活性铜的碳点（CuCDs）[19]， XPS分析该碳点中的铜呈现0和+1价， 该材料能够将活性铜对UA的选择性检测与碳点优良的电催化性质结合起来。

本研究首先采用水热法合成含有活性铜的碳点，通过电沉积法将其修饰在玻碳电极表面，制备CuCDs/GCE电极，如图1所示。利用碳点较大的比表面積和高的电子传递速率， 以及活性铜对电极界面上基质的电子转移速率的促进作用和对UA的选择性，实现对UA的测定。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

F4000型荧光分光光度计（日本日立公司）； Shimadzu 3600 UVVis光谱仪（日本岛津公司）； CHI660A电化学工作站（上海辰华仪器有限公司），采用三电极系统：以饱和甘汞电极为参比电极，Pt丝电极为对电极，裸玻碳电极（GCE，φ=3 mm）或修饰玻碳电极为工作电极； ZF20D暗箱三用紫外分析仪（上海骥辉科学仪器有限公司）。

聚甲基丙烯酸钠（PMAA，30%，Sigma 公司）； UA、AA、多巴胺（DA）、Cu（NO3）2、K3Fe（CN）6、K4Fe（CN）6（国药集团化学试剂有限公司）。0.100 mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS）由NaH2PO4、Na2HPO4和KCl 配制，并用0.100 mol/L H3PO4或NaOH调节pH值。实验所用试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

2.2 含有活性铜碳点的制备

采用水热法一步合成含有活性铜碳点[20]： 首先称取2.50 g PMAA和适量Cu（NO3）2于烧杯中，加入50.0 mL去离子水， 混合均匀后倒入水热反应釜中，240℃反应9 h。 所得产物13000 r/min离心30 min， 去除溶液中的大颗粒残渣。用截留分子量为1 kD的透析袋透析纯化12 h， 最终在4℃下避光保存。

不含活性铜碳点的制备方法同上，所不同的是将PMAA和Cu（NO3）2的混合溶液换成PMAA溶液。

2.3 修饰电极的制备

分别用粒径为1.00、0.30和0.05 μm的氧化铝粉末配合麂皮打磨电极，再依次用丙酮、乙醇和去离子水超声清洗。将其置入含有活性铜的碳点溶液中，利用电沉积法，在0～2.0 V的电位范围以100 mV/s扫速循环扫描10圈，制得CuCDs/GCE电极。将打磨好的玻碳电极置于不含活性铜的碳点溶液中，在相同条件下电化学沉积制得CDs/GCE。

3 结果与讨论

3.1 CuCDs的表征

透射电镜（图2A）显示， 所合成的CuCDs具有良好的结晶性和单分散性，平均粒径为5.5 nm。紫外可见吸收光谱（图2B（a））显示， CuCDs从紫外区到可见区均有吸收， 且在260 nm附近有一个明显的紫外吸收峰。CuCDs在365 nm波长紫外灯激发下发出强的蓝绿色荧光。对其荧光性能进行研究发现，在350 nm激发波长下获得位于460 nm的最大发射，如图2B（b）所示，与文献[20]报道的一致。

3.2 修饰电极的电化学表征

CuCDs通过电沉积法形成CuCDs/GCE，沉积过程如图3A所示。在外加电场下，表面包覆了PMAA的CuCDs以平行方式沉积到电极表面。用交流阻抗技术对此电极进行表征。图3分别为裸GCE，CDs/GCE和CuCDs/GCE在Fe（CN）36溶液中的交流阻抗图谱。裸GCE的电子转移阻抗值为90.0 Ω，CDs修饰到电极表面后，其阻抗值降至78.0 Ω，表明其电子转移阻碍性变小，说明CDs具有良好的导电性。当CuCDs修饰后，阻抗仅为68.0 Ω，表明活性铜能促进电极表面的电子传递，电荷传输电阻减小。这证明了CuCDs已成功固定于电极表面，且活性铜和碳点两者能够产生协同效应， 有利于电荷传输。

3.3 UA在CuCDs/GCE上的电化学响应

为了实现对UA的电化学检测，考察了100 μmol/L UA在不同修饰电极上的电化学行为。如图3C所示， UA在裸GCE上无明显的峰，而在CDs/GCE上有一个微弱的峰，位于0.326 V。在电极表面引入CuCDs后， UA在0.299 V呈现一个尖锐的氧化峰， 比CDs/GCE的氧化峰电位负移了0.027 V，且峰电流增加了2.30倍。这表明CuCDs/GCE对UA的氧化具有较好的催化作用。推测原因如下：一是碳点的颗粒较小，具有非常大的比表面积和高的电子传递速率； 二是活性铜的引入能有效改善电极的导电性，促进了电极界面上基质的电子转移速率； 三是活性铜在碳点表面的均匀分布更好地发挥了协同催化效应。

3.4 pH值和扫速的影响

图4A为不同pH值下UA 在CuCDs/GCE上的循环伏安曲线。由图4A可见，UA在pH 7.0的PBS中获得了最大峰电流。鉴于人体体液为中性环境，故UA检测时选择pH 7.0的PBS为支持电解质。UA的氧化峰电位随pH值的增加而发生明显负移。且与pH值呈良好的线性关系，线性方程为E（mV）=0.807-0.0705pH （R2=0.995），斜率为70.0 mV/pH，与理论值59.0 mV/pH相接近[21]，表明UA的电化学反应是一个等质子等电子的过程。根据文献[22]，UA的氧化是一个两电子参与的过程，因此电极上UA的反应近似为两电子两质子过程，方程式如式（1）所示。

在10～200 mV/s范围内，研究了扫描速度对UA氧化峰电流的影响。图4B为不同扫速下CuCDs/GCE在含有UA的PBS缓冲液中的循环伏安图，UA的氧化峰电流随扫速的增加而增大，且呈线性关系， 线性方程为I=0.0589V-2.58 （R2=0.9976），表明UA在CuCDs/GCE受吸附控制。

3.5 电化学检测

最佳条件下，采用示差脉冲伏安法对不同浓度的UA进行检测。如图5所示，UA的氧化峰电流随其浓度的增加而增大。在1.00～300 μmol/L范围内，峰电流与UA浓度呈良好的线性关系，线性方程式为I=0.0613C +1.0453 （R2=0.993），检出限为0.30 μmol/L （S/N=3）， 比较了不同修饰电极对UA检测的线性范围和检出限。如表1所示，本传感器线性范围更宽，检出限更低，具有更好的检测性能。

3.6 干扰实验

UA的测定干扰主要来自AA、DA和葡萄糖。 在最佳条件下，分别考察1.0 mmol/L的AA和葡萄糖、0.100 mmol/L DA对UA测定的影响。如图6A所示，此修饰电极能很好地区分AA和UA，且响应信号的相对标准偏差（RSD）小于5.0%。 DA（图6B）和葡萄糖（图6C）也对UA的测定无影响，说明此电极的选择性良好。

3.7 传感器的重现性与稳定性

分别考察了CuCDs/GCE的稳定性和重现性。在UA浓度为100 μmol/L时，测得6根电极的电化学响应电流的相对标准偏差为4.30%，表明此传感器具有良好的重现性。将传感器置于4℃保存1个月，对UA测定的电化学信号标准偏差为6.50%，表明此传感器对UA的测定具有良好的稳定性。

3.8 实际样品中UA浓度的测定

利用修饰电极对5份血清样本进行了分析，并与医院检测结果比对（表2），结果表明，此电极可用于实际样品的测定。

4 结 论

采用水热法制得含有活性铜的碳点，采用电沉积法将其固定在电极表面，制得电化学传感器。利用碳点较大的比表面积和高的电子传递速率，及活性铜对电极界面上基质的电子转移速率的促进作用和对尿酸的选择性，实现对尿酸的选择性测定。此传感器制备简单，且能够有效消除抗坏血酸和多巴胺对尿酸测定的干扰，表现出线性范围宽、重现性与稳定性好、抗干扰能力强等优点，有望应用于实际样品的检测。

References

1 Huang S， Liao H， Chen D. Biosens. Bioelectron.， 2010， 25： 2351-2355

2 Feig D， Mazzali M， Kang D. J. Am. Soc. Nephrol.， 2006， 17（4）： 69-73

3 Sun Y， Chen J， Qi H， Shi Y. J. Chromatogr. B， 2015， 1004： 53-59

4 Wu D， Lu H F， Xie H， Wu J， Wang C， Zhang Q. Sens. Actuators B， 2015， 221： 1433-1440

5 Fang A， Wu Q， Lu Q， Chen H， Li H， Liu M， Zhang Y， Yao Z. Biosens. Bioelectron.， 2016， 86： 664-670

6 Ma L， Shi H， Lian K， Diao Y， Chen Y， Ma C， Kang W. Food Chem.， 2017， 218： 422-426

7 FAN XueMei， WANG ShuMin， LI ZheJian， ZHENG XingWang. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， 44（3）： 342-347

樊雪梅， 王書民， 李哲建， 郑行望. 分析化学， 2016， 44（3）： 342-347

8 Liu H， Gu C， Hou C， Yin Z， Fan K， Zhang M. Sens. Actuators B， 2016， 224： 857-862

9 ZHU WeiQiong， LI Rong， XIONG Jian， GOU XingLong. Journal of Instrumental Analysis， 2012， 31（4）： 153-157

朱伟琼， 李 容， 熊 健， 苟兴龙. 分析测试学报， 2012， 31（4）： 153-157

10 Ghanbari K， Hajheidari N. Anal. Biochem.， 2015， 473： 53-62

11 Zhou S， Shi H， Feng X， Xue K， Song W. Biosens. Bioelectron.， 2013， 42： 163-169

12 Hiroaki S， Ranko H， Kazuhiro M， Haruki S， Susumu S. Anal. Sci.， 2011， 27： 333-335

13 Ibrahim H， Temerk Y. J. Electroanal. Chem.， 2016， 780： 176-186

14 Baker S， Baker G. Angew. Chem. In. Ed.， 2010， 49（38）： 6726-6744

15 Jiang K， Sun S， Zhang L， Lu Y， Wu A， Cai C， Lin H. Angew. Chem. Int. Ed.， 2015， 54（18）： 5360-5363

16 Wang Y， Shi W， Wang S， Li C， Qian M， Chen J， Huang R. Carbon.， 2016， 108： 146-153

17 Fang D， Gao G， Shen J， Yu Y， Zhi J. Electrochim. Acta， 2016， 222： 303-311

18 Sarswat P， Free M. Phys. Chem. Chem. Phys.， 2015， 41： 27642-27652

19 Ren X， Liu J， Ren J， Tang F， Meng X. Nanoscale， 2015， 7： 19641-19646

20 Hao H， Sun Y， Lin Y， Huang L. Electrochim. Acta， 2007， 52（20）： 6165-6171

21 HUANG HaiPing， XU Liang， YUE YaFeng， LYU LianLian. Chinese J. Anal. Chem.， 2017， 45（1）： 111-117

黃海平， 徐 亮， 岳亚锋， 吕连连. 分析化学， 2017， 45（1）： 111-117

22 Li H， Jiao S， Li M. Electrochim. Acta， 2014， 121： 233-239

23 Hou C， Liu H， Zhang D， Yang C， Zhang M. J. Alloys Compd.， 2016， 666： 178-184

24 Wang C， Du J， Wang H， Zou C， Jiang F， Yang P， Du Y. Sens. Actuators B， 2014， 204： 302-309