王准 温思萌 朱识淼 蔡启亮 蒋宁 尚芝群 王海涛 牛远杰

·论著·

去势抵抗性前列腺癌的病因学分型研究和临床精准医疗实践探索

王准 温思萌 朱识淼 蔡启亮 蒋宁 尚芝群 王海涛 牛远杰

前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤，我国前列腺癌发病率呈逐年上升趋势，且多数患者诊断时已为中晚期前列腺癌，虽经过雄激素剥夺治疗(androgen deprivation therapy，ADT)能使疾病得到一定程度上的缓解，但大多数前列腺癌患者发展为去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer，CRPC)，此类患者预后差。虽然针对CRPC制定的有相应的诊治指南，并推荐了相应的治疗方案。然而，这些指南的制定主要根据疾病症状的严重程度做出分类，从而给出相应的治疗方案，尽管在一定程度上改善了CRPC的治疗效果，但其适用范围有限。我们根据多年的前列腺癌基础研究和临床研究，提出了CRPC 的三类形成机制，即(1)雄激素受体(androgen receptor，AR)相关机制、(2)干细胞形成机制和(3)神经内分泌转化机制。并根据CPRC的异质性、多样性及其多种形成机制，对CPRC从病因学分为三种类型，即Ⅰ型：雄激素-雄激素受体(Androgen-AR)信号依赖性，分子标志物为FKBP5；Ⅱ型：肿瘤干细胞型，分子标志物为YaP1；Ⅲ型：神经内分泌型，分子标志物为NTS。同时我们结合二代测序技术，针对不同CRPC分型进行了临床精准医疗实践探索，采取精准医疗手段个体化治疗CRPC，尤其是耐药性的CRPC，并取得明显疗效。

去势抵抗性前列腺癌; 病因学分型; 精准医疗

前列腺癌是西方男性的最常见的恶性肿瘤之一，并且是造成男性肿瘤死亡的第二大病因[1]。我国前列腺癌的发病率近年来呈逐年快速上升趋势，由2004年的5.8/10万人，到2009年的8/10万人。中国香港地区是发病率绝对值上升最快区域，由1999年的16.5/10万人上升到2010年的28.1/10万人[2-4]。在上海和台湾地区，前列腺癌分别已经位列男性常见肿瘤的第一位和第五位。因此加强前列腺癌的基础研究和临床防止已变得尤为迫切。然而，由于对前列腺癌易感人群的筛查工作相对落后，导致我国晚期前列腺癌约占初诊前列腺癌的70%[5]，且初诊为晚期前列腺癌的比例远高于西方国家(20～30%)。这部分患者的最主要治疗方法是雄激素剥夺治疗(Androgen deprivation therapy，ADT)[6]。尽管在ADT 治疗初期前列腺癌被不同程度的控制，但经过大约18 个月敏感期后，大部分患者的疾病逐渐且不可逆地进展为CRPC[7]。

CRPC指前列腺癌患者经过初次持续ADT治疗后，血清睾酮水平达到去势水平(<50 ng/dl 或<1.7 nmol/L)，但是疾病依然进展的前列腺癌。疾病进展可表现为影像学可见的肿瘤进展和前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)水平持续增高—即在PSA达2 ng/mL 以上，每间隔1周监测血清PSA水平，连续3 次血清PSA升高，且较基础值升高50%以上。然而，由于CRPC发病机制至今不明，因而临床缺乏针对病因的精准治疗，这是当前泌尿外科学研究的难点和热点。我国和欧美国家都针对CRPC制定出相应的疾病诊治指南，其主要依据患者有无转移、有无症状、有无化疗史以及患者体能状态好坏等进行分类，并推荐了相应的治疗方案，包括化疗、内分泌治疗、核素与生物治疗等多学科综合治疗。然而，这些指南的制定并非建立在CPRC病因学的基础上，而是根据疾病症状的严重程度做出分类，从而给出相应的治疗方案，尽管在一定程度上使得CRPC的治疗效果有所改善，但这些治疗方式适用范围有限、花费昂贵，只局限于一小部分患者受益，且许多高龄患者对治疗不良反应耐受差，生存质量低。这就需要新的治疗策略来提高CRPC的疗效。

肿瘤的治疗策略的转变过程可分为局部治疗时代，化疗时代，以及在分子诊断技术出现后的精准医疗个体化治疗时代。可大致视为寻找与破坏肿瘤到靶向与控制肿瘤的转变。精准医疗是整合了每个个体的分子信息和临床数据，为精确的疾病分子分类提供支撑，以提高疾病的个体化治疗[8]。其核心是基于个体基因组信息的个体化治疗。通过测序等医学前沿技术，精确寻找疾病病因和治疗的靶点，最终实现疾病和特定患者的个性化精准治疗。但是要从大量的测序信息中准确挖掘出某一个特定患者的确切分子机制，而且基因测序所找到的突变基因，不一定就有合适的靶向治疗药物，这就需要基于蛋白、信号传导系统对疾病进行分子分型，从而确定一类型，有针对性的用药。

我们根据多年的前列腺癌基础研究和临床研究，根据CPRC的异质性、多样性及其多种形成机制，结合二代测序技术，从病因学上对CPRC进行分型，针对不同分型采取精准医疗手段进行临床个体化治疗CRPC，尤其是耐药性的CRPC更具指导意义。

材料与方法

一、一般资料

20例CRPC患者，在ADT治疗不敏感后，通过经尿道前列腺电切或前列腺穿刺活检获取耐药后前列腺标本，通过免疫组化测FKBP51，Yap1，和NTS表达水平。通过二代测序获取其主要基因突变。

二、免疫组化检测方法

获取CRPC患者前列腺癌标本，福尔马林固定后，石蜡包埋，将手术取得的前列腺标本用福尔马林溶液固定24 h后进行蜡块制备并制作5 um防脱切片进行免疫组织化学染色。染色结束后于显微镜下观察结果。

三、二代测序技术

将获取的CRPC患者前列腺癌新鲜标本，以无菌PBS或生理盐水清洗干净切为小块后立刻放入液氮中冷冻2～3小时后可转入-80℃冰箱保存。冻存组织可放入干冰中直接运输至测序公司进行基因测序。

结 果

一、CRPC存在不均一性

首先，患者对ADT 治疗的敏感程度不同。有的患者对ADT治疗非常敏感，治疗后PSA快速降低至0.2 ng/mL以下；部分患者在ADT治疗后PSA水平虽有下降，但是达不到0.2 ng/mL；少部分患者在ADT治疗后PSA不下降，呈无效。而且前列腺癌患者接受ADT治疗后有效期长短不同。有的患者仅在短期内有效(<1年)，这样的患者约占10～15%；也有患者长期有效(>5年)，占15～20%；大多数患者ADT的有效性维持2～5年。

我们进一步研究发现，同为CRPC，不同患者组织病理学的表现形态不一致，在不同CRPC标本中，光镜下肿瘤的基质和上皮组织构成不同，AR的表达水平也存在差异。而且，CRPC的临床和组织病理学表现型存在差异，而更重要的是CRPC的基因型也存在广泛差异。

还有，CRPC的基因型存在不均一性，在我们的前期研究工作中，通过基因芯片分析了209例未经治疗的前列腺癌和29 例CRPC标本，我们发现CRPC 的基因型存在明显差异，如果不附加条件进一步分类，难以在29 例CRPC标本中发现一致性的差异[9]。而CRPC 的表现型和基因型差异提示CRPC 可能存在不同的形成机制，说明CPRC是异质性的。

二、CRPC的病因学分型

我们在多年的前期研究和文献复习的基础上，提出了CRPC 的三类形成机制，即(1)AR 相关机制。(2)干细胞形成机制和。(3)神经内分泌转化机制。并根据CPRC的异质性、多样性及其多种形成机制，对CPRC在病因学上进行分类。将CPRC分为三种类型，即Ⅰ型：雄激素-雄激素受体(Androgen-AR)信号依赖性，分子标志物为FKBP51；Ⅱ型：肿瘤干细胞型，分子标志物为YaP1；Ⅲ型：神经内分泌型，分子标志物为NTS。

Ⅰ型：雄激素-雄激素受体(Androgen-AR)信号依赖性。CRPC的形成依赖于雄激素-雄激素受体信号路。CRPC中的AR相关机制，主要指导致前列腺癌组织中雄激素受体敏感性增高的机制，其包括因前列腺癌细胞中AR转录增多致使肿瘤对雄激素的敏感性增加；AR突变扩大了其结合特异性，致使其能被生长激、孕酮和雌激素等激活；其他信号系统交叉活化AR信号系统；AR共调节因子表达增加致使AR可被去势水平的雄激素和抗雄药物激活；AR-v7剪切体可使AR在没有配体的条件下激活AR下游信号通路等等[10-13]。FKBP51于上世纪八十年代被发现，因其蛋白结构包含457个氨基酸，分子量51k道尔顿，得名FKBP51。FKBP51可以参与多种信号通路的调控与激活，其中比较重要的有雄激素受体信号通路、PI3K-AKT信号通路以及核因子κB(NF-κB)信号通路。近年来越来越多的研究关注FKBP51在前列腺癌发生发展及激素抵抗过程中的作用。已有学者证明FKBP51蛋白受雄激素受体AR调控，AR可以结合于FKBP51基因DNA转录区下游的增强子位点上，通过招募cAMP反应原件来促进其蛋白表达[14]。另外一组研究也证实，FKBP51不但受AR调控表达，同时可以通过与 HSP90的相互作用而结合于AR蛋白上，调控AR的入核能力，影响AR 生物学功能的发挥[15]。我们的前期研究表明FKBP51在去势抵抗性前列腺癌的发生发展中发挥重要作用，其通过与长链非编码RNA PCAT-1共同作用，调节NF-κB及AKT信号通路，促进前列腺癌细胞的生长并抑制其凋亡，从而促进去势抵抗性前列腺癌的发生。 提示FKBP51有可能成为治疗去势抵抗性前列腺癌的一个新的药物靶点[16]。此类型的靶向治疗可针对AR信号，AKT/NFκB进行靶向治疗。

Ⅱ型：肿瘤干细胞型。前列腺肿瘤干细胞或祖细胞可能是导致ADT治疗失败的根本原因[17]。干细胞至具有自我更新和多向分化潜能的细胞，其可通过细胞分化形成某一特定组织成熟的细胞。正常前列腺干细胞先分化为过渡-放大细胞，然后分化为中间分化细胞，最终分化为上皮分泌细胞。肿瘤干细胞指一种具有无限再生潜能的肿瘤细胞。其特点是占肿瘤细胞总数的极小部分；具有自我更新和增殖的能力；通过分化再现来源肿瘤的表型等。已有研究表明，前列腺上皮基底细胞是干/祖细胞的来源，基底细胞是前列腺癌的起源[18]。YAP(Yes-associated protein)基因位于染色体11q22.1，其编码分子量为65 kDa的富含脯氨酸的蛋白[19]，YAP包含了四个结构域：WW结构域、PDZ相互作用结构域、SH3结合结构域和卷曲螺旋结构域[20]。因YAP的c末端无DNA结合结构域，因此被称为转录共活化因子，YAP 蛋白c末端的4 个氨基酸与蛋白质PDZ结构域相互作用起到转录激活作用，对YAP进行亚细胞定位调节起到重要作用[21]已有研究发现，在胚胎干细胞、神经干细胞、造血干细胞中，YAP- TEAD2的高表达能够维持干细胞干性并且已经成为维持干性的标志物[22]新的研究发现YAP参与Sox2-YAP-Hippo途径调控肿瘤干细胞[23]。我们通过蛋白质组学和组织免疫组化中发现筛选出YAP1蛋白在前列腺癌CRPC组织中活性增高，并证实YAP1 蛋白高表达于前列腺基底细胞[9]。且YAP1在去势抵抗性肿瘤中被活化，其可通过调节Sox2、Nanog等基因在前列腺癌干/祖细胞的生长调节中起到关键作用。此类型的靶向治疗可靶向肿瘤干细胞信号，精准医学筛选信号。

Ⅲ型：神经内分泌型(neuroendocrine，NE)，分子标志物为神经加压素(Neurotensin，NTS)。CRPC形成的重要机制之一就是前列腺癌细胞在去势治疗后发生的神经内分泌转化[24-25]。即前列腺癌细胞在诱导下转化为具有神经内分泌细胞样功能的肿瘤细胞，这些细胞不再依赖于AR信号通路，不受雄激素调节，并具有刺激周围肿瘤细胞发生激素抵抗的增殖作用。前列腺癌小鼠模型中，肿瘤的分化程度与细胞NE转化程度密切相关，去势后肿瘤转变为激素非依赖性肿瘤，伴有严重的NE转化现象和更强的侵袭性和转移性[26]。临床多中心研究表明，经ADT治疗后的前列腺癌发生NE转化几率显著升高，且与ADT治疗时间呈正相关。我们的前期实验研究发现，NTS的水平与组织中NE标记物(CgA和NSE)的表达水平呈显著相关性，并且在CRPC标本中NTS水平显著高于去势治疗前。此类型的靶向治疗可针对NEPC的药物，如多烯他噻化疗，精准医学筛选信号。

我们将CRPC分为以上三种类型，表1为部分CRPC患者的分型研究结果。

表1 部分CRPC患者的分型研究结果

三、临床精准医疗实践探索

我们基于FDA已批准的上市的分子靶向药物，运用cBioPortal工具对150例CRPC患者进行相应的靶基因改变进行了系统分析，并证实了精准医疗在CRPC治疗中的重要价值[27]。 我们还发起了亚洲第一个晚期前列腺癌第一个精准治疗伞形临床试验，招募合适的参与者。初步结果显示：根据不同的耐药特征，给予CRPC个体化治疗可获得明确的疗效[28]。同时发现一些新出现的治疗靶点，如BRCAness、KDR、mTOR pathway、MET amplification等。

我们对一例典型终末期CRPC患者进行了个体化精准治疗，此患者在诊断为前列腺癌时已发生骨转移和腹膜后淋巴结转移，在经过一期和二期治疗后，仍然发生了肝转移，我们通过对其前列腺癌标本进行二代测序，发现PALB2基因高表达(表2)，我们针对PALB2进行个体化精准治疗，明显延长了其生存时间，获得显著疗效。我们对另一例肺转移的典型终末期CRPC患者前列腺癌标本进行二代测序，发现AKT1和SETD2高表达(表3)，是雄激素-雄激素受体(Androgen-AR)信号依赖型为主，针对其进行个体化精准治疗，2个月后，肺转移结节明显减少。

表2 一例典型终末期CRPC患者前列腺癌标本测序结果

表3 一例肺转移CRPC患者前列腺癌标本二代测序结果

我们还对2例前列腺低分化癌，AR(+)为表型的雄激素-雄激素受体(Androgen-AR)信号依赖型CRPC患者进行针对性的应用阿比特龙进行治疗，随访近12个月，均取得满意的疗效。对3例以神经内分泌型为主的CRPC患者根据其突变基因分子表型给予相应的治疗方案，也取得满意疗效(表4)。

表4 部分CRPC患者个体化治疗疗效观察

讨 论

前列腺癌是老年男性的常见恶性肿瘤，是造成男性肿瘤死亡的第二大病因[1]。在我国，受人口老龄化，饮食结构改变及医疗水平的提高等因素影响，前列腺癌呈逐年上升趋势[2-4]。而且我国大多数前列腺癌在诊断时就已处于中晚期，尽管在ADT治疗初期前列腺癌被不同程度的控制，但经过大约18 个月敏感期后，大部分患者的疾病逐渐且不可逆地进展为去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer，CRPC)[7]，这部分患者预后极差，生存期仅约为12个月[29]。虽然我国和欧美国家都针对CRPC制定出相应的疾病诊治指南，并制定相应的治疗方案，且在一定程度上使得CRPC的治疗效果有所改善，但其主要依据患者有无转移、有无症状、有无化疗史以及患者体能状态好坏等进行分类，其适用范围小、费用高，受益患者数量有限，且多数患者生存质量低。

CRPC的异质性主要表现在其不均一性和多种形成机制上。CRPC的发生机制比较复杂，主要分为雄激素受体依赖性和非依赖性。雄激素受体依赖性信号途径在CRPC的发生发展中发挥重要作用。主要涉及雄激素受体转录增多、AR突变、AR信号系统交叉活化、AR共调节因子表达增加、AR-v7剪切体等[10-13]。

雄激素受体的非依赖机制主要涉及肿瘤干细胞和神经内分泌转化。前列腺肿瘤干细胞不表达，且其生长不依赖于雄激素受体，这使得其在雄激素剥夺情况下生存并获得抵抗性[11，13]。我们发现YAP1蛋白在前列腺癌CRPC组织中活性增高，而且YAP1蛋白高表达于前列腺肿瘤干细胞所处的前列腺基底细胞。而且YAP1在去势抵抗性前列腺癌中被活化，在前列腺癌干/祖细胞的生长调节中起到关键作用。前列腺癌神经内分泌转化多由雄激素剥夺治疗引起[30]，在去势抵抗性前列腺癌中预后极。我们发现NTS的水平与组织中NE密切相关。NTS具有促进前列腺癌细胞发生NE 转化的作用。

新一代测序技术应用于CPRC为其精准医疗发展奠定了基础。Beltran等[31]对25例CRPC标本进行全基因组测序发现CRPC中主要的基因变异包括AR异常(44%)、TMPRSS2-ERG融合基因(44%)、PTEN缺失(44%)、TP53突变(40%)、RB缺失(28%)、C-MYC 扩增(12%)、BRCA2 缺失(12%)、ATM突变(8%)和PIK3CA突变(4%)。Robinson等[32]在对150例CRPC患者的肿瘤组织进行了全基因外显子组和全转录组测序中，40%～60%的患者中存在AR、ETS、TP53和PTEN 的频发突变，主要涉及AR、DNA修复、PI3K、Wnt、细胞周期等信号通路，综合分析显示89%CRPC患者均携带着至少一种激活突变，在说明CRPC存在遗传异质性的同时，为精确筛选CRPC治疗靶点提供了强有力的支持。标志着CRPC治疗已进入到个体化精准治疗的新时代。

我们在CRPC临床分期的基础上，尝试将CRPC从病因学角度进行分型，同时结合二代测序技术，筛选出CRPC主要突变基因，通过临床精准医疗，个体化治疗CRPC，以期更加有效的治疗CRPC。

当然，将精准医学完全转化为理想有效的临床治疗手段仍存在一定困难，临床标本重复获取存在一定困难，大多数患者在治疗中并未利用活检获得标本；基因测序结果解读难度大；通过测序获得结果指导个体化治疗是存在困难，如测序预测的适用药物超出临床适应症，药物价格偏贵，超出患者经济承受力等等。但鉴于鉴于精准医学个体化治疗在肿瘤治疗方面的重要作用获得充分肯定，欧美国家和我国也已开始广泛关注精准医学的研究，相信在不久的将来，精准医学及个体化治疗将得到快速发展，开辟肿瘤治疗的新途径。

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(本文编辑：徐文聃)

10.3969/j.issn.1005-6483.2017.07.025

300211 天津医科大学第二医院 天津市泌尿外科研究所

牛远杰，Email：niuyuanjie9317@163.com

2017-01-26)