张莉莉，杨 峰，李宏胜，王益民，刘龙海，张 哲，王 丹，张亚茹，李新圃，罗金印

（1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，农业部兽用药物创制重点实验室，甘肃省新兽药工程重点实验室，兰州 730050；2.兰州大学公共卫生学院，兰州 730000）

奶牛乳房炎大肠杆菌的青霉素耐药特征研究

张莉莉1，2，杨 峰1，李宏胜1，王益民2，刘龙海1，张 哲1，王 丹1，张亚茹1，李新圃1，罗金印1

（1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，农业部兽用药物创制重点实验室，甘肃省新兽药工程重点实验室，兰州 730050；2.兰州大学公共卫生学院，兰州 730000）

为了研究奶牛乳房炎大肠杆菌的青霉素耐药特征，采用药敏纸片法检测了123株大肠杆菌对青霉素的耐药性，并利用β-内酰胺酶试剂盒测定耐青霉素株β-内酰胺酶活性，同时采用刚果红法和改良结晶紫半定量方法检测生物被膜的形成能力。结果表明：123株受试大肠杆菌中，对青霉素耐药的菌株有122株，耐药率99.19%。122株耐青霉素大肠杆菌中，生物被膜检测为阳性的菌株有92株（75.41%），β-内酰胺酶检测为阳性的有72株（59.02%）；β-内酰胺酶阳性而生物被膜阴性的菌株有15株（12.30%），β-内酰胺酶和生物被膜同为阳性的有57株（46.72%）；β-内酰胺酶为阴性但生物被膜为阳性的菌株有35株（28.69%）。92株生物被膜阳性菌株中，29株（31.52%）具有强成膜能力，61株（66.30%）具有中等成膜能力，2株（2.17%）成膜能力较弱。说明奶牛乳房炎大肠杆菌对青霉素的耐药率较高；大肠杆菌青霉素耐药性受β-内酰胺酶和生物被膜多种因子的共同调控。

奶牛乳房炎；大肠杆菌；青霉素；耐药性；β-内酰胺酶；生物被膜

大肠杆菌是引起奶牛乳房炎的常见病原菌，给奶牛养殖业带来了巨大的经济损失［1-2］。目前，抗生素疗法仍是治疗细菌性奶牛乳房炎的首选方法［3］。青霉素常用于治疗大肠杆菌引发的乳房炎，然而由于长期、广泛、盲目的滥用，导致大肠杆菌青霉素耐药性菌株逐年增加，耐药谱增宽，给临床治疗带来了极大的困难［4］。

大肠杆菌对抗菌药物的耐药性主要依赖于菌株自身携带的各种相关耐药基因［5］。青霉素耐药基因blaZ可编码β-内酰胺酶，该酶能够水解β-内酰胺环，从而使β-内酰胺类抗生素失活［6］。此外，随着对耐药机制研究的深入，近年来发现临床上耐药菌株的增加不仅与抗生素的不合理使用有关，也与生物被膜的形成密切相关［7］。细菌形成生物被膜吸附于惰性或活性材料表面，将自身包裹于其分泌的胞外多糖基质形成群体结构，致使抗菌药物难以接近病原菌，导致其耐药性明显增强［8］。

近年来，国内外关于畜牧业生产中大肠杆菌青霉素耐药性的研究日益受到重视，然而有关我国西北地区牛源大肠杆菌青霉素耐药特征的报道相对较少。本研究以中国西北地区奶牛乳房炎病例中所分离鉴定的大肠杆菌为研究对象，研究其青霉素耐药表型与β-内酰胺酶和生物被膜的关系，旨在为阐明我国西北地区奶牛乳房炎青霉素耐药特征奠定基础，为采取合理的防治策略提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 123株大肠杆菌菌株于2016年从甘肃地区部分奶牛场采集的奶牛乳房炎乳汁样品中分离获得，由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所微生物课题组分离鉴定和保存。

1.1.2 主要试剂与药品 Mueller-Hinton培养基、Mueller-Hinton肉汤、胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptic Soy Broth，TSB）培养基、脑心浸出粉、蔗糖、葡萄糖（G）、无水乙醇、无水甲醇，均购于广东环凯生物科技有限公司；琼脂、刚果红、0.2%结晶紫、药敏纸片，均购于英国Oxoid公司；β-内酰胺酶试剂盒购于Omega公司。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验 严格按美国临床实验标准委员会标准［9］，采用纸片扩散法进行药敏试验。

1.2.2 β-内酰胺酶活性检测 β-内酰胺酶的测定严格依照β-内酰胺酶试剂盒操作说明书进行。

1.2.3 生物被膜定性检测 将过夜培养的大肠杆菌菌液接种于刚果红培养基，37℃培养24 h后观察菌落形态及颜色。粗糙、干燥、结晶样的黑色菌落为生物被膜阳性菌株，而红色的光滑型菌落为生物被膜阴性菌株［10］。

1.2.4 生物被膜半定量检测 采用结晶紫染色法，按参考文献［11］进行。将菌液于TSB肉汤中过夜培养，用TSB+ 1%G培养液1∶100稀释菌液，然后取200μL菌液接种于96孔板中，37℃培养箱中培养24 h。弃去上清，用PBS清洗3次。每孔加入150μL无水甲醇固定20min，弃去上清，晾干。每孔加入150μL结晶紫，染色15min。弃去染液，PBS冲洗3次。每孔中加200μL无水乙醇，室温静止30min。酶标仪测定OD570，阴性对照组为无水乙醇。每株细菌接种3个平行孔，结果取平均值。根据OD570值的不同将生物被膜形成能力分为4类：OD≤ODC，无成膜能力（－）；OD＜ODC≤2OD，弱成膜能力（+）；2OD＜ODC≤4OD，中等成膜能力（++）；OD＞4ODC，强成膜能力（+++）。

2 结果与分析

123株大肠杆菌受试菌株中，对青霉素耐药的有122株，耐药率达99.19%。

由表1可知，122株耐青霉素大肠杆菌中，生物被膜检测为阳性的菌株有92株（75.41%），β-内酰胺酶检测为阳性的有72株（59.02%）；β-内酰胺酶阳性而生物被膜阴性的菌株有15株（12.30%），β-内酰胺酶和生物被膜同为阳性的有57株（46.72%）；β-内酰胺酶为阴性但生物被膜为阳性的菌株有35株（28.69%），β-内酰胺酶和生物被膜同为阴性的菌株有15株（12.30%）。对92株生物被膜检测为阳性的大肠杆菌生物被膜形成能力分析，结果显示：29株（31.52%）具有强成膜能力，61株（66.30%）具有中等成膜能力，2株（2.17%）成膜能力较弱（图1）。

表1 122株耐青霉素大肠杆菌β-内酰胺酶和生物被膜定性检测

图1 92株耐青霉素大肠杆菌生物被膜形成能力分析

3 讨论

大肠杆菌是引发奶牛乳房炎的最主要病原菌之一，大量耐药菌株的出现给抗菌药物治疗大肠杆菌性奶牛乳房炎带来了新的难题，其中大肠杆菌青霉素耐药菌株尤为突出。我国学者王礼伟等［12］的研究结果表明，新疆石河子地区奶牛乳房炎大肠杆菌青霉素耐药率高达100%；王娟［13］报道，扬州地区奶牛乳房炎大肠杆菌青霉素耐药率大于90%。在本实验中，大肠杆菌对青霉素的耐药率99.19%，与上述报道相近。该结果可能与青霉素长期、大量、不规范地用于治疗奶牛乳房炎密切相关［14］。

β-内酰胺酶是大多数临床分离病原菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性的主要因素［15］。刘玉文等［16］研究发现，产β-内酰胺酶的金黄色葡萄球菌对多种抗生素均表现出不同程度的耐药性，其中对青霉素和氨苄青霉素耐药率均为98.2%。本研究中，大肠杆菌青霉素耐药菌株中，59.02%的菌株β-内酰胺酶检测为阳性，说明β-内酰胺酶在大肠杆菌青霉素耐药性中发挥着重要作用，此结果与管海宁等［17］的报道相似；40.98%的菌株β-内酰胺酶检测为阴性但表现为青霉素耐药，推测其对青霉素产生耐药性可能是依赖于其他耐药机制如生物被膜的形成［18］。国内外相关研究表明，超过80%的细菌感染与生物被膜的形成相关，细菌形成生物被膜后，对抗生素的耐药性可增加10～1000倍［19-20］。本实验中，75.41%的大肠杆菌青霉素耐药菌株可产生生物被膜，且主要为强成膜能力和中等成膜能力菌株，此结果与贾艳华等［21］报道的数据相近。此外，46.72%的菌株β-内酰胺酶和生物被膜均检测为阳性，说明生物被膜不仅在牛源大肠杆菌的青霉素耐药性中发挥着重要作用，而且生物被膜的产生也可增加β-内酰胺酶的活性［22］。

细菌对青霉素产生耐药性的机制较为复杂，β-内酰胺酶或生物被膜虽然在细菌产生青霉素耐药性中发挥重要作用，但对青霉素耐药的菌株并不意味着一定会产生β-内酰胺酶或生物被膜［23］。本实验中，122株青霉素耐药菌株中，15株β-内酰胺酶和生物被膜同检测为阴性，可能是因为细菌菌体表面的青霉素结合蛋白（penicillin binding protein，PBP）变异降低了与青霉素的亲和力所致［24］，具体原因还需进一步的研究和分析。

综上所述，奶牛乳房炎大肠杆菌对常用抗生素青霉素的耐药率较高，建议临床上给药前先做诊断，以便选择合适药物进行治疗；大肠杆菌青霉素耐药性受β-内酰胺酶和生物被膜等多种因子共同调控。

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Penicillin-resistant Characterization of Escherichia coli Isolated from Bovine Mastitis

Zhang Lili1，2，Yang Feng1，LiHongsheng1，etal
（1.Lanzhou InstituteofHusbandryand PharmaceuticalScienceofCAAS，Key Laboratory ofVeterinary PharmaceuticsDiscovery，MinistryofAgriculture，Key LaboratoryofNew AnimalDrug ProjectofGansu Province，Lanzhou 730050，China；2.SchoolofPublic Health，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China）

The aim of this studywas to investigate the penicillin resistantcharacterization of Escherichia coli isolated from bovine mastitis.The penicillin resistance was determined by disk diffusion method，β-lactamase test kit was used to detect the β-lactamase activity，biofilm formation was tested with Congo red Agar and semi-quantitative adherence assay method.The results showed that，in all tested E.coli，122 isolateswere resistant to penicillin，the resistance ratewas 99.19%.Among the 122 penicillin-resistant E.coli strains，72（59.02%）isolateswere identified asβ-lactamase producers，and 92（75.41%）isolates produced biofilm.In addition，15（12.30%）biofilm-negative strain was identified asβ-lactamase producer.Meanwhile，57（46.72%）isolateswerepositive forboth ofβ-lactamaseand biofilm，35（28.69%）β-lactamase-negativestrainswere identified as biofilm producers.The results of semi-quantitative adherence assaymethod showed that，among the 92 isolates bioflm producer，29（31.52%）weredetected asstrongbioflm producer，61（66.30%）weredetected asmoderatebioflm producer，and 2（2.17%）were detected asweak bioflm producer.The study indicated that E.coli exhibited high resistance rates to penicillin，and implied that E.coli resistant to penicillinwasattributed tomultiplemechanisms.

bovinemastitis；Escherichia coli；penicillin；resistance；β-lactamase；biofilm

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.04.010

S823.7

A

2095-3887（2017）04-0038-04

2017-05-08

项目期金：国家自然科学基金项目（81402703，81550046）

张莉莉（1989-），女，硕士研究生。

李宏胜（1964-），男，研究员，博士。研究方向：奶牛乳房炎免疫及预防。