晏 萧， 夏纪毅， 程 波， 朱永生， 姜 睿△

(西南医科大学附属医院 1泌尿外科， 2医学实验中心， 四川 泸州 646000)

·实验技术·

靶向S1P2基因的siRNA有效片段慢病毒载体的筛选*

晏 萧1， 夏纪毅2， 程 波1， 朱永生1， 姜 睿1△

(西南医科大学附属医院1泌尿外科，2医学实验中心， 四川 泸州 646000)

目的： 筛选能显著抑制原代培养的自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR) 阴茎海绵体平滑肌细胞内1-磷酸鞘氨醇受体2(sphingosine-1-phosphate receptor 2，S1P2)基因表达的siRNA慢病毒载体。方法: SHR及SD大鼠各5只用于原代培养阴茎海绵体平滑肌细胞并分成6组，每组5个样本，每个样本约1.0×105个细胞，分别为携带靶向S1P2基因的siRNA-1～3号靶点的SHR慢病毒转染组(SHR siRNA-1、SHR siRNA-2和SHR siRNA-3组)、 携带慢病毒空载体的SHR转染组(SHR GFP组)、SHR未转染对照组(SHR control组)和SD大鼠对照组(SD control组)。将靶向S1P2的siRNA片段的慢病毒载体，以感染复数(MOI)= 60转染各组SHR阴茎海绵体平滑肌细胞，于转染72 h后荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况，用Western blot分析各组S1P2、ROCK1、ROCK2和eNOS在阴茎海绵体平滑肌细胞内的表达变化，RT-PCR检测各组阴茎海绵体平滑肌细胞S1P2、ROCK1和ROCK2的mRNA 的表达。结果: 荧光显微镜下观察SHR siRNA-1、SHR siRNA-2、SHR siRNA-3和SHR GFP组细胞转染效率均>80%；SHR GFP组与SHR control组相比，S1P2、ROCK1和ROCK2的mRNA和蛋白表达无明显差异， SHR siRNA-1、SHR siRNA-2、SHR siRNA-3和SD control组均显著低于SHR control组(P<0.05)。而SHR siRNA-1、SHR siRNA-2、SHR siRNA-3和SHR GFP组eNOS蛋白表达与SHR control组相比均无显著差别，但SD control组显著高于SHR control组(P<0.05)。结论: 3组针对S1P2的siRNA慢病毒载体均能显著抑制SHR阴茎海绵体平滑肌细胞内S1P2的表达，下调ROCK1和ROCK2表达，其中靶向S1P2的siRNA-1抑制效率最高。

自发性高血压大鼠； 1-磷酸鞘氨醇受体2； 小干扰RNA； 慢病毒载体

阴茎勃起是一个由血管、神经共同调节的复杂生理过程，涉及多条信号通路，其中一氧化氮(nitric oxide，NO)/环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)信号通路障碍、RhoA/Rho激酶信号通路的激活等原因都可导致勃起功能障碍(erectile dysfunction，ED)的发生。40岁以上男性中有近40%患有不同程度的ED，且ED患病率随着年龄增加[1]。此外，心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)危险因素(如血脂异常、高血压、糖尿病、吸烟、肥胖、代谢综合征等)与ED的发生显著相关[2]。E……