郑锦畅 康银辉 魏波 祝兆波 王朝军 林颢 李广盛 郭伟雄 荆凯鹏 孙欣 彭智恒

广东医科大学附属医院骨科中心，广东 湛江 524001

糖皮质激素(Glucocorticoids, GCs)被广泛用来治疗过敏性、自身免疫性和炎症性疾病，但长时间应用会不同程度的引起骨量丢失，甚至会发生骨坏死[1,2]。这可能与激素抑制成骨细胞的分化、增殖，促进成骨细胞、骨细胞的凋亡等相关[3]。有研究发现激素作用后的股骨头内骨细胞胞质中有大量的脂质沉积[4,8]。是何种原因导致该现象发生，目前尚无明确解释，为阐明这一现象本文拟用皮质酮以不同浓度、时间作用于成骨细胞，观察细胞中脂质沉积现象及脂质合成相关基因与下游酶的表达特点，从而分析可能机制的所在。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：新生24 h内SD胎鼠，购于广西医科大学动物实验中心。

1.1.2主要药物及试剂：皮质酮(日本梯希爱)；反转录试剂盒，SYBR®Green qPCR荧光染料(大连宝生物公司)；SDS(Sigma公司)；Tweenn20(BIOSHARP公司)；蛋白Marker(Thermo Science)；SREBP1一抗兔抗鼠，SREBP2一抗兔抗鼠，HMGCR一抗兔抗鼠，FAS一抗兔抗鼠(SANTA CRUZ公司)；HRP标记的驴抗山羊二抗，蛋白酶抑制剂(上海碧云天公司)；蛋白酶裂解液(上海贝博公司)；化学发光试剂盒(天根公司)；HRP标记的山羊抗兔二抗(北京中杉金桥公司)； Nile Red(上海源叶科技公司)；茜素红S(上海华东试剂公司)。

1.1.3主要仪器设备：LightCycler480荧光定量PCR仪[罗氏(上海)有限公司]；激光共聚焦显微镜[罗氏(上海)有限公司]；CO2培养箱(Thermo赛默飞世尔科技公司)；OLYMPUS光学倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；SDS-PAGE凝胶电泳仪(BIO-RAD)。

1.2 实验方法

1.2.1皮质酮溶液配制：将34.6 mg皮质酮粉剂溶入10 mL的DMSO(二甲基亚砜，dimethyl sulfoxide)中，充分混匀，配成10 μmol/mL的贮存液，存放于4 ℃，使用前用培养基逐级稀释成100、10、1、0.1、0.01 μmol/L的溶液进行实验。

1.2.2成骨细胞的分离：提取SD胎鼠(出生24 h内)成骨细胞，无菌取下胎鼠颅骨，放入无菌PBS中浸泡并剔去骨膜等物质，然后用剪刀将颅骨头剪成1×1 mm3大小的组织块，移至15 mL离心管中，加入5mL 0.25%胰蛋白酶，37 ℃水浴消化30 min，去掉胰蛋白酶后加入含0.2%的Ι型胶原酶的消化液消化，消化6个循环，每次在37 ℃水浴消化30 min，取第3、4、5、6次消化的细胞悬液，1 300 r/min离心10 min，弃上清，沉淀的细胞用不含血清的高糖DMEM洗剂离心1次，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬吹打均匀后，以1×105/mL接种于培养瓶中，放入5%CO2,、37 ℃的培养箱中培养，24 h换液, 以后每2～3 d换液并在显微镜下观察细胞生长情况， 待细胞长至半汇合铺满瓶底时， 用0. 25%胰蛋白酶进行消化、 传代。

1.2.3成骨细胞的鉴定：①成骨细胞形态观察：每日在倒置显微镜下观察细胞生长。②将传到第三代的细胞以2×105个/mL接种到铺有盖玻片的六孔板中进行细胞爬片，3～4 d后将盖玻片捞出进行细胞内碱性磷酸酶染色，倒置显微镜下观察。③茜素红染色：称取0.1 g茜素红粉剂溶于100 mL蒸馏水中配成0.1%的茜素红溶液，将细胞爬片10～14 d后的盖玻片捞出，用PBS轻轻冲洗两遍，用0.1%的茜素红溶液染色30 min后蒸馏水冲洗两遍，封片，倒置显微镜下观察。

1.2.4成骨细胞增殖能力分析：将传到第三代的细胞以5×104/mL密度接种于96孔板，在37 ℃，95%O2，5%CO2细胞培养箱中培养6 h，使细胞完全贴壁。以0、0.01、0.1、1、10、100 μmol/L的皮质醇作用24、48、72 h后，以CCK-8法测定细胞存活率。

1.2.5实验分组：实验随机分为A、B、C、D组(皮质酮作用浓度分别为0、0.1、1、10 μmol/L)，每组作用24、48、72 h三个时间段，作用后各组细胞Nile Red脂质染色，实时荧光定量PCR法测定各组细胞SREBP1、SREBP2、HMGCR、FAS的mRNA表达, Western blot测SREBP1、SREBP2、HMGCR、FAS蛋白表达。

(1)Nile Red染色：将A、B、C、D组爬片成骨细胞用PBS冲洗两遍，每个盖玻片避光滴一滴0.1%Nile Red的溶液于37 ℃的水浴箱中染色10 min，10 min后取出玻片PBS冲洗，开启激光共聚焦荧光显微镜进行观察。

(2)mRNA检测： 以 105/孔的密度将细胞接于 6孔板中, 加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，再加入皮质酮作用浓度分别为0、0.1、1、10 μmol/L培养液, 培养24，48，72 h后提取总RNA，经过浓度测定、逆转录反应后行实时荧光定量PCR反应。SREBP1、SREBP2、HMGCR、FAS和内参β-actin引物序列见表1。反应条件为首先95 ℃变性30 s；然后按95 ℃ 5s，60 ℃ 20 s扩增40个循环。每个组的标本重复3次。在反应的第二阶段，在每个循环结束后采集荧光信号强度，60～95 ℃间进行融解曲线分析，以分析反应中引物的特异性。测得的Ct值来计算每个样本目的基因的相对表达量。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences for PCR.

注：F: Forward Sequence R: Reverse Sequence

(3)蛋白表达检测：采用Western blot法。提取各组细胞总蛋白，蛋白质定量试剂盒(BCA)法测定蛋白浓度，与5×缓冲液混合，100 ℃变性5 min。各种一抗以1∶1000稀释，内参(β-actin)按1∶2000稀释，二抗按1∶5000的比例稀释。

1.3 统计学处理

本实验数据用SPSS 17.0统计软件进行分析，所有数据均先进行正态性与方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析，拟P<0.05差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞分离与鉴定

成骨细胞倒置显微镜观察：原代细胞培养1 d后贴壁，细胞呈梭形、多角形，7～10 d单层铺满瓶壁。传代细胞多为梭形。(图1 A、B)

碱性磷酸酶(ALP)染色：取第三代细胞做碱性磷酸酶(ALP)染色，呈棕黄色为阳性(图1 C)。

茜素红(钙化结节染色)染色：细胞汇合时均呈多层重叠生长，细胞局部堆集成灶状，形成钙结节，染色后钙结节呈橘红色(图1 D)。

2.2 不同浓度皮质醇对成骨细胞增殖的影响

CCK-8示：高浓度皮质酮对细胞增值有抑制作用，随着浓度增加，对细胞增值抑制明显增加，地塞米松浓度在0.01 μmol/L～100 μmol/L均可抑制细胞增殖，并呈浓度依赖性。

2.3 不同浓度皮质酮作用后成骨细胞内脂质及相关基因、蛋白表达的变化

2.3.1Nile Red染色：Nile Red染色提示，皮质酮作用成骨细胞后，成骨细胞内的脂质染色随皮质酮浓度增高染色增强；同一皮质酮浓度在作用24、48、72 h时成骨细胞内脂质染色无明显差异。

图2 A：皮质醇作用24 h后成骨细胞的存活率；B：皮质醇作用48 h后成骨细胞的存活率；C：皮质醇作用72 h后成骨细胞的存活率(与对照组比较，*P<0.05)Fig.2 A: The survival rate of osteoblasts conditioned with cortisol after 24 h; B: The survival rate of osteoblasts conditioned with cortisol after 48 h; C: The survival rate of osteoblasts conditioned with cortisol after 72 h. (*Compared with the control group, P<0.05)

图3 激素对成骨细胞作用24、48、72 h后 Nile Red染色结果红色荧光表示脂质在细胞内的沉积A: 0 B: 0.1 C: 1 D: 10 (μmol/L)Fig.3 The Nile red staining results of osteoblasts conditioned with the hormone after 24 h, 48 h, and 72 h Red fluorescent lipid deposition in a cellA: 0; B: 0.1; C: 1; D: 10 (μmol/L).

2.3.2应用皮质酮后荧光定量PCR测定成骨细胞脂质调节基因与酶表达：从测定的结果可以看出当不同的浓度的激素分别作用24 h后，细胞内SREBP1、SREBP2、HMGCR、FAS酶的基因表达量升高(P<0.05)，但当作用的时间延长到48、72 h后，脂质合成的SREBP1、SREBP2、HMGCR、FAS酶的基因表达量呈下降趋势(P<0.05)(图 4)。

2.3.3蛋白免疫印迹检测成骨细胞内SREBP1、SREBP2、HMGCR、FAS蛋白的表达量：皮质醇1μmol/L作用24 h后与对照组相比，SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR的表达升高；皮质醇1μmol/L作用48 h后与对照组相比，SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR未见明显差异；皮质醇1μmol/L作用72 h后与对照组相比，SREBP1、FAS表达降低，SREBP2表达升高，HMGCR未见明显差异(图5)。

3 讨论

激素性股骨头坏死是糖皮质激素(glucocorticoids, GCs)应用的严重并发症。目前研究表明有关激素性股骨头坏死的发病机制主要有：一是激素对成骨细胞、骨细胞、破骨细胞的直接作用，抑制成骨细胞的分化、增殖，促进成骨细胞、骨细胞的凋亡，延长破骨细胞的生存期，最终导致骨量丢失，股骨头塌陷；二是激素的间接作用，通过促进血管内皮细胞的凋亡导致血栓形成，抑制血管内皮生长因子表达使血管修复及新生血管形成障碍，影响血管收缩和舒张活性物质的表达及脂质代谢，抑制性激素的分泌，减少小肠对钙离子的吸收及促进尿中钙离子的流失等[5]。但就激素如何发挥作用，其具体的分子作用机制还有待进一步研究。

近来有关的研究表明，糖皮质激素可以通过脂肪细胞来间接的影响成骨细胞的增殖、分化及功能。激素抑制骨髓内骨髓间充值干细胞转录因子Cbfa1/Runx2表达，促使特异性转录因子PPARγ的表达，从而促使骨髓间从质干细胞向脂肪细胞分化，抑制其向成骨细胞的分化，导致脂肪细胞数量/成骨细胞数量比例增加[6,7]。

Kawai等[4]发现在应用大剂量甲强龙治疗兔子4周后，首先出现高脂血症和脂肪肝，电子显微镜观察后可发现股骨头部位的骨细胞内出现逐渐增大的脂滴，细胞核被挤压到无脂滴的一侧，最终出现细胞裂解，但是他们未能证明激素性股骨头坏死与骨细胞内脂质沉积的相关性。Maruno等[8]同样发现激素作用后出现骨细胞内脂质沉积，在同时应用克利贝特(一种新型的纤维酸类降脂新药)后骨细胞内的脂质沉积降低。

图4 不同浓度的皮质酮对成骨细胞作用24、48、72 h后对细胞内SREBP1、SREBP2、HMGCR、FAS基因表达的影响(与对照组比较，*P<0.05)Fig.4 The effects of different concentrations of corticosterone on the osteoblasts of the gene expression in SREBP1, SREBP2, HMGCR and FAS after 24 h, 48 h and 72 h

图5 蛋白免疫印迹检测成骨细胞内SREBP1、SREBP2、HMGCR、FAS蛋白的表达量Fig.5 The expressions of SREBP1, SREBP2, HMGCR and FAS protein in osteoblasts detected by Western blot

就成骨细胞而言，应用糖皮质激素后骨细胞内可出现大量脂质沉积[4,8]，这是否也是激素性骨损害原因之一，目前未见明确解释，那么激素影响下成骨细胞内出现脂质的原因到底是如何？因此本研究观察了成骨细胞在激素影响后，脂质合成相关的基因与关键酶的表达，初步探讨这一现象。

SREBP是一种转录调节因子，分为SREBP1和SREBP2两型，其中SREBP1主要调节细胞内脂肪酸和甘油三酯的含量，SREBP2主要调节细胞内胆固醇的含量。FAS由一条多肽链构成的多功能酶，通常以二聚体形式存在，在体内主要催化脂肪酸的合成， HMGCR在体内主要促进胆固醇的合成。当细胞内脂肪酸、甘油三酯及胆固醇的含量降低时，SREBP1、SREBP2的基因转录会上升，进而促进相应的FAS、HMGCR的表达，使细胞内脂肪酸、胆固醇的含量增多，相反，当细胞内脂质含量增高时，会抑制SREBP1、SREBP2的表达，进而减少胞内脂质的合成[9,10]。盛辉等[11]指出在激素性骨坏死发生过程中，早期血管外脂肪堆积表现为大量生成的小脂肪细胞，后期血管外脂肪堆积表现为脂肪细胞出现肥大。

本文应用多次酶消化法获得大鼠成骨细胞，鉴定后用于实验。不同浓度皮质酮作用成骨细胞后可见细胞内Nile Red脂质染色随皮质酮浓度增高染色增强，而相同浓度皮质酮在作用成骨细胞24、48、72 h时细胞内脂质染色无明显差异，提示皮质酮可以促使成骨细胞内脂质的增加，造成脂质的细胞内过度积聚，这种作用与皮质酮浓度相关。

本文通过对细胞内脂肪酸、胆固醇合成的相关的限速酶基因表达观察发现当皮质酮浓度0.1、1、10μmol/L作用24 h后，SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR的基因表达升高，但作用时间延长到48、72 h，SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR的基因表达量降低，这可能是由于激素通过24 h的作用，使成骨细胞内脂质沉积到一定的量后反馈抑制了细胞内脂质合成相关酶的基因表达，使脂质合成相关的酶的基因表达量下降。

通过荧光定量PCR可以发现在作用24 h后，不同浓度皮质酮均可促进SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR的基因表达升高，本研究选取皮质酮浓度为1μmol/L做蛋白免疫印迹实验，成骨细胞在皮质酮作用 24 h后，与对照组相比，SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR的表达升高；皮质醇1μmol/L作用48 h后与对照组相比，SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR未见明显差异；皮质醇1μmol/L作用72 h后与对照组相比，SREBP1、FAS表达降低，SREBP2表达升高，HMGCR未见明显差异，这可能是由于激素作用成骨细胞24 h后细胞内的脂质合成的增多，出现SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR表达的升高；但是在24～48 h的某个时间，细胞内的脂质蓄积到一定程度，开始反馈抑制成骨细胞内脂质合成，SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR表达开始下降，与对照组相比差异不明显；而在作用的72 h出现了SREBP1、FAS表达降低，SREBP2表达升高，HMGCR未见明显差异，这可能是由于激素对成骨细胞内脂肪酸、甘油三酯、胆固醇合成作用的不同引起。

文献[12-14]表明生理剂量的激素(≤10-8mol/L)可以促进成骨细胞的分化，然而超生理剂量的激素降低成骨细胞的活性，抑制成骨细胞的分化。本研究采用的激素浓度为0.1、1、10μmol/L，为超生理剂量浓度，均能促进成骨细胞内脂质异常蓄积。

因此，通过目前研究可以得出超生理剂量糖皮质激素可能通过促进脂质合成过程中相关酶基因及蛋白表达来促进成骨细胞内脂质的沉积，这种作用与激素的浓度明显相关。但激素是否通过促进其胞内脂质沉积来对成骨细胞产生负面作用，或者能否通过抑制激素作用的成骨细胞内脂质合成中的某一条通路，从而达到预防激素性股骨头坏死的目的，还有待进一步探讨。