刘振涛 张怡元 林煜 王武炼 冯尔宥 林丽琼 肖莉莉

厦门大学附属福州第二医院骨科，福建 福州 350007

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)指主要由雌激素水平降低引起的骨质疏松，为高转换型骨质疏松症，即骨形成与骨吸收均较活跃。临床主要表现为骨折风险和骨痛增加，严重影响患者的生活质量，甚至出现死亡。

PMOP的中医病因病机为肾虚脾虚血瘀等, 尤以肾虚的关系密切[1-2]。肾主骨生髓，骨质疏松的首责在于肾虚, 治疗当以补肾为主[3]。骨质疏松相关的肾虚证型有肾阳虚、肾阴虚和肾阴阳两虚之分，目前中药复方的基础研究大多围绕肾阳虚证展开。统计发现，患者除了表现为肾阳虚证外，另有相当一部分病人表现为肾阴虚证[4-6]，甚至有高达82%的病人比例见诸报端[7]。

临床观察证明,滋补肾阴可对肾阴虚型PMOP患者有理想的治疗效果[8-9]。相关研究证明：滋补肾阴代表方二至丸可明显提高肾阴虚骨质疏松模型大鼠骨矿含量、骨密度和骨影面积，升高血清中雌二醇水平[10-14]，进而改善骨质疏松。因此我们随机收集临床42至50岁不同年龄段符合纳入标准的围绝经期妇女松质骨，分离培养体外成骨细胞，通过观察二至丸干预前后围绝经期妇女成骨细胞数量，骨形态蛋白-2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)、雌激素受体α(estrogen receptor α,ER-α)、骨钙素(osteocalcin,OCN)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)水平变化，来探究二至丸对骨质疏松的影响及作用机理。

1 材料和方法

1.1 实验试剂和仪器

碱性磷酸酶AKP测定剂盒(南京建成生物工程研究所)，骨钙素(OCN)酶联免疫吸附测试试剂盒(SC公司)，反转录试剂盒RR037Q， SYBRPremix Ex TaqTM PCR Kit RR42LR(TaKaRa公司)。二氧化碳恒温培养箱(BB16/BB5060型，德国Heraus公司)，BT224半自动生化分析仪(意大利生物技术公司)，7900型实时定QPCR仪(美国ABI公司)。

1.2 纳入标准

取自2013年6月至2014年6月厦门大学附属福州第二医院关节外科新鲜股骨颈骨折行髋关节置换术患者，经知情同意后取材。患者均为女性，年龄42～50周岁，出现月经改变现象，伴有出汗、阵发性潮热、抑郁、记忆力减退、烦躁不安等围绝经期综合征的临床表现。符合《原发性骨质疏松诊疗指南》[15]中骨质疏松症的诊断标准，临床表现以腰背疼痛为主，伴有全身性疼痛，腰膝酸软无力，并逐步加重，术前双能X射线检查骨密度减少2个标准差以上，血清骨转换指标P1NP大于41. 6 ng /mL，S-CTX大于0.56 μg /L等。

1.3 排除标准

①有糖尿病、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺等内分泌疾病者；②有肾脏疾病和代谢性疾病者；③有骨关节肿瘤、结核、感染等病史者；④有长期服用影响骨代谢的药物史。

1.4 临床研究对象分组

符合纳入标准病例在测试完骨密度和血清骨转换指标(P1NP和S-CTX)后，具体分组如下：绝经前骨量正常组、绝经前骨量减少组、绝经后骨量正常组、绝经后骨质疏松组。各组成骨细胞的培养条件采用预实验后选取效果最好的25 μg·mL-1二至丸粗提液与含体积分数为15%小牛血清的DMEM-F12培养液。

1.5 人成骨细胞的分离与培养

将手术中取下的股骨头清除骨表面结缔组织、软骨，PBS冲洗3次，将松质骨剪至1 mm3大小，再用PBS冲洗后，胰酶37℃消化30 min，弃胰蛋白酶，加入Ⅱ型胶原酶，37℃消化1h，收集上清液，转移至离心管中，1000 r/min离心10 min，收集细胞；加入DMEM培养液(含15%NCS)，吸管反复吹打成细胞悬液，置于37 ℃、体积分数为0.95的CO2培养箱中培养。

1.6 药物提取

取3000 g女贞子粉碎成粗粉，10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1小时，合并提取液,减压浓缩回收乙醇,最终将提取液浓缩至3000 mL (每1 mL相当于原药材1 g)，-20 ℃储藏备用。取3000 g墨旱莲药材，10倍量水回流提取2次，每次1小时，合并提取液,减压浓缩回收水，最终将提取液浓缩至3000 mL(每1 mL相当于原药材1 g)，-20 ℃储藏备用。临用前取同体积女贞子、墨旱莲粗提液混合均匀，得二至丸粗提液。

1.7 人成骨细胞增殖检测

根据预实验选取效果最好的25 μg·mL-1作为二至丸的最终实验浓度。各组成骨细胞以2×103/mL孔密度接种于96孔板内，72 h后采用MTT法分析各组成骨细胞增殖的情况，以酶标仪570 nm处测得OD值表示结果。

1.8 细胞液中AKP、BMP-2、OCN的测定

分别按照各试剂盒说明书。

1.9 qPCR法检测BMP-2、OCN和ER-α mRNA的表达

收集干预72 h的各组成骨细胞，加入Trizol提取细胞总RNA并计算出RNA的浓度，根据浓度计算出需要逆转录的RNA的体积后，按逆转录试剂盒的步骤进行反转录。BMP-2、OCN和ER-α的扩增引物由上海生工公司合成。反转录后在ABI7900上按照说明书进行mRNA扩增，在得到扩增曲线与CT值后，设复孔取平均值，每个样本指标重复3次。使用7900 system SDS 软件计算数据，进行组间相对量的比较。

表1 PCR所用引物序列Table 1 The primer sequences for PCR

1.10 统计学处理分析

2 结果

2.1 二至丸对人成骨细胞增殖的影响

MTT法检测发现干预前各组细胞增殖能力依次为绝经前骨量正常组最佳、绝经后骨量正常组次之、绝经前骨量减少组再次之、绝经后骨质疏松组最差，各组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；采用浓度为25 μg·mL-1二至丸粗提液干预后，各组成骨细胞的增殖能力较干预前显著上升，其中绝经前骨量正常组最佳、绝经后骨量正常组次之、绝经前骨量减少组再次之、绝经后骨质疏松组最差，绝经后骨量正常组与绝经前骨量减少组比较差异无统计学意义，其余各组比较差异均有统计学意义，各组与同组干预前比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 二至丸对人成骨细胞增殖的影响Table 2 Effects of EZW on the proliferation

注：与同组干预前比较，aP<0.05；与同时期绝经前骨量正常组比较，bP<0.05；与同时期绝经前骨量减少组比较，cP<0.05；与同时期绝经后骨量正常组比较，dP<0.05；与同时期绝经后骨质疏松组比较eP<0.05

2.2 二至丸对人成骨细胞细胞液中AKP表达的影响

采用比色法检测培养液，结果显示干预前各组细胞液中AKP浓度从高到低依次为：绝经前骨量正常组最高、绝经后骨量正常组次之、绝经前骨量减少组再次之、绝经后骨质疏松组最低。绝经后骨量正常组与绝经前骨量减少组著异无统计学意义，其余各组组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)；采用二至丸粗提液干预后，各组成骨细胞液中AKP的表达较干预前显著上升，各组与同组干预前比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 二至丸对人成骨细胞细胞液中AKP表达的影响Table 3 Effects of EZW on the expression of AKP in culture

注：与同组干预前比较，aP<0.05；与同时期绝经前骨量正常组比较，bP<0.05；与同时期绝经前骨量减少组比较，cP<0.05；与同时期绝经后骨量正常组比较，dP<0.05；与同时期绝经后骨质疏松组比较，eP<0.05

2.3 二至丸对人成骨细胞细胞液中BMP-2、OCN表达的影响

采用ELISA法检测培养液，结果显示，干预前，绝经前骨量正常组细胞液中BMP-2、OCN浓度最高、绝经后骨量正常组次之、绝经前骨量减少组再次之、绝经后骨质疏松组最低，各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)；采用二至丸粗提液干预后，各组成骨细胞细胞液中BMP-2、OCN浓度较干预前显著上升，各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表4、表5。

表4 二至丸对人成骨细胞细胞液中BMP-2表达的影响Table 4 Effects of EZW on the expression of BMP-2 in culture fluid of

注：与同组干预前比较，aP<0.05；与同时期绝经前骨量正常组比较，bP<0.05；与同时期绝经前骨量减少组比较，cP<0.05；与同时期绝经后骨量正常组比较，dP<0.05；与同时期绝经后骨质疏松组比较，eP<0.05

2.4 二至丸对人成骨细胞BMP-2、OCN和ER-α mRNA表达的影响

结果显示：干预前，绝经前骨量正常组细胞液中BMP-2、OCN和ER-α mRNA表达最高、绝经后骨量正常组次之、绝经前骨量减少组再次之、绝经后骨质疏松组最低，绝经后骨量正常组与绝经前骨量减少组无显著差异，其余各组组间比较较均有显著性差异(P<0.05)，干预后各组成骨细胞BMP-2、OCN和ER-α mRNA的表达均高于干预前，各组组间比较均有显著性差异(P<0.05)。见表6、表7、表8。

表5 二至丸对人成骨细胞细胞液中OCN表达的影响Table 5 Effects of EZW on the expression of OCN in

注：与同组干预前比较，aP<0.05；与同时期绝经前骨量正常组比较，bP<0.05；与同时期绝经前骨量减少组比较，cP<0.05；与同时期绝经后骨量正常组比较，dP<0.05；与同时期绝经后骨质疏松组比较，eP<0.05

表6 二至丸对人成骨细胞BMP-2mRNA表达的影响Table 6 Effects of EZW on the expression of BMP-2 mRNA

注：与同组干预前比较，aP<0.05；与同时期绝经前骨量正常组比较，bP<0.05；与同时期绝经前骨量减少组比较，cP<0.05；与同时期绝经后骨量正常组比较，dP<0.05；与同时期绝经后骨质疏松组比较，eP<0.05

表7 二至丸对人成骨细胞OCNmRNA表达的影响Table 7 Effects of EZW on the expression of OCN mRNA

注：与同组干预前比较，aP<0.05；与同时期绝经前骨量正常组比较，bP<0.05；与同时期绝经前骨量减少组比较，cP<0.05；与同时期绝经后骨量正常组比较，dP<0.05；与同时期绝经后骨质疏松组比较，eP<0.05

3 讨论

原发性骨质疏松症的主要发病机制在于骨吸收大于骨形成，成骨细胞在骨重建过程中发挥着主导作用。成骨细胞体外培养技术在骨代谢的研究中非常重要，不仅可为筛选骨代谢相关疾病提供细胞模型，还是研究骨代谢机制的重要手段之一。目前，人成骨细胞的主要来源为新生儿颅骨[13]和成人松质骨[14]，由于新生儿颅骨来源的成骨细胞增殖分化较旺盛，与骨质疏松患者的成骨能力差异较大，且取材不符合伦理学的要求，因此我们选用围绝经期成人骨折后的松质骨标本，且均经患者同意，签署知情同意书。后用胰蛋白酶多次消化取得的成骨细胞，更接近于骨质疏松成骨细胞功能状态，数量较多，形态多样，生长稳定，有明显的成骨细胞特征，研究结果可能更接近于临床。本实验随机收集临床符合纳入标准的围绝经期妇女松质骨培养出原代成骨细胞，连续传代增殖，纯度较高，有稳定的细胞生物学特征，具有良好的细胞增殖分化与成骨活性[16]。

表8 二至丸对人成骨细胞ER-α mRNA表达的影响Table 8 Effects of EZW on the expression of

注：与同组干预前比较，aP<0.05；与同时期绝经前骨量正常组比较，bP<0.05；与同时期绝经前骨量减少组比较，cP<0.05；与同时期绝经后骨量正常组比较，dP<0.05；与同时期绝经后骨质疏松组比较，eP<0.05

现代医学研究证明,绝经后雌激素水平下降，骨量丢失，是公认的PMOP发生的关键性因素[17]，有统计显示，大于50岁的女性因骨质疏松所致骨折风险可增加20%[18]。绝经后妇女因卵巢功能减弱，雌激素水平降低，导致骨骼中钙结合能力下降，破骨细胞的骨吸收能力增强，骨质丢失速度增快，引起骨量减少、骨脆等[19]。雌激素主要通过结合雌激素受体(ER)作用于骨组织，调节成骨细胞的生长，调控骨吸收和骨形成的平衡，因此,ER在骨质疏松症的发生过程中发挥了重要的枢纽作用[20]。雌激素受体之一ER-α与雌激素结合后，可发挥促进成骨细胞增殖的生物学效应[21]。本实验的检测发现：二至丸干预后各组的ER-α mRNA表达明显高于干预前各组。由此推测二至丸可能通过上调成骨细胞ER-α mRNA的表达，基因转录活性进一步升高，直接加速成骨细胞增殖分化，或间接地激活胞外信号调控激酶，促进成骨细胞增殖分化，抑制成骨细胞凋亡。药理实验证实,滋补肾阴中药可提高血清雌二醇水平,而雌激素水平下降与骨质疏松的发生显著相关[22-23],所以二至丸可能通过提高血清雌激素水平,来增加骨密度、骨矿含量和骨影面积,改善绝经后骨质疏松症状。

同时，本实验还运用比色法、RT-PCR法和ELISA法检测AKP蛋白、BMP-2mRNA、BMP-2蛋白、OCNmRNA和OCN蛋白的表达,发现：二至丸干预前后这些物质的表达均有明显改变，且干预后明显高于干预前(P<0.05)。骨钙素(OCN)属于一种主要由成骨细胞合成分泌的具有促进成骨作用的γ-羧谷氨酸包含蛋白，大部分沉积于骨基质，维持骨的正常矿化，是骨基质矿化的必需因子，只有小部分释放入血[24]，骨中含量与血中含量成正相关性，可直接反映成骨细胞的活动状态和骨钙化的速率[25-26]，是成骨细胞中期的功能性标志物，可以作为骨质疏松动态变化的评价指标。骨形态发生蛋白(BMPs)由成骨细胞分泌酸性糖蛋白[27]，是唯一可以单独诱导骨组织形成的局部生长因子。其中BMP-2是诱导成骨和刺激成骨细胞分化活性最强的BMPs之一[28]，具有启动成骨的全部潜能。碱性磷酸酶(AKP)是成骨细胞分泌的一种胞外酶，主要功能是在成骨时水解磷酸脂，为羟基磷灰石的沉积提供必要的磷酸，同时水解焦磷酸盐，使其对骨盐形成的抑制作用得到解除，促进细胞外基质的矿化，利于成骨[29-30]，是细胞骨化所必须的的酶,其表达活性是成骨细胞增殖和早期分化的明显标志之一。由检测结果可得：二至丸能够通过某种未知的作用促进成骨基因BMP-2、OCN以及AKP蛋白的表达，促进骨形成。

药理研究发现，二至丸的主要成分女贞子和墨旱莲中含有萜类、黄酮类和香豆草醚类化合物等物质，其结构与雌二醇相似而具有雌性激素样作用[31-32]，对成骨细胞增殖和分化均有促进作用，能有效地防治骨质疏松，又可避免为机体带来其他副作用。由此，本研究结果结合相关文献推测其机制，可能是二至丸中含有类雌激素样物质能够有效促进成骨细胞中ER-α表达并结合，继而提升BMP-2、OCN以及AKP基因和蛋白表达量，从而促进成骨细胞的增殖分化和成骨功能。

综上，本实验在细胞水平观察了二至丸对成骨细胞增殖分化的影响，发现其治疗骨质疏松的作用机制与其促进成骨细胞增殖分化的效用切实相关，为二至丸治疗骨质疏松症提供了理论和实验依据。然而其促进成骨细胞增值分化抗骨质疏松的具体成分和分子机制并不十分清楚，在下一步的研究中，我们将从这一方面着手，为本实验所反映的现象作进一步的论证和分析。