李钺 谢炜星 晋大祥 温龙飞 丁金勇 徐继禧

广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405

随着老年化社会的到来，骨质疏松症已成为一个严重的社会问题，危害着中老年人的健康。骨质疏松症是一种骨代谢疾病，它是以骨微细结构破坏、低骨量、骨折风险增加为特点。它有许多并发症，包括骨折、残疾以及慢性疼痛[1]。骨形成和骨吸收在其发病机制中起到了重要的作用。成骨细胞参与骨形成，破骨细胞参与骨吸收，骨质疏松的原因就是骨吸收增加而骨形成作用减弱，最终导致骨量减少。

研究发现，在各种类型的骨质疏松发病过程中都伴随着氧化应激水平的升高[2]。氧化应激是因为细胞内的抗氧化作用和活性氧的产生之间的不平衡，从而对细胞产生不利影响。生理水平的活性氧对于保持正常的成骨细胞功能是有益的，而当细胞内活性氧的积累明显增加时，氧化应激将对成骨细胞造成严重危害，并将导致骨质疏松[3]。

腺苷酸活化蛋白激酶(amp-activated protein kinase，AMPK)是细胞内的能量和代谢感受器，AMPK的激活对于调节整个细胞的能量和代谢平衡至关重要[4]。研究发现，AMPK被激活后，对保护成骨细胞免受氧化应激的损害发挥重要作用。本文就AMPK的激活与成骨细胞关系及作用机制的最新进展作一综述。

1 AMPK的介绍

1.1 AMPK的结构和功能

AMPK是由α、β、γ3个亚单位组成的三聚体，分别按照α∶β∶γ=1∶1∶1的比率组成，其中发挥催化作用的是α亚基，起调节作用的是β和γ亚基。α、β、γ亚基含有多种基因编码的异构体(α1、α2、β1、β2、γ1、γ2、γ3)[5]。见图1。

AMPK的主要功能元素是α亚基，其包含蛋白激酶域(KD)、α-钩状结构(α-hook)和自我抑制序列(AID)以及一个与β亚基链接的C-末端(α-CTD)4个重要结构域[6]。蛋白激酶域(KD)包含一个丝氨酸/色氨酸激酶区，其中含有一个苏氨酸(Thr-172)位点，该位点的磷酸化是酶活化所必需的。自我抑制序列(AID)的功能是抑制AMPK的催化作用，C-末端(α-CTD)形成一个球状域，这个球状域与β亚基的C-末端连接起来，此结构对于形成α、β、γ的稳定结构意义深远[5]。

β亚基被认为是蛋白激酶的骨干，它有两个特殊的区域，糖原链接域(GBD)和α、γ亚单位结合域(β-CTD)。它的调节功能涉及碳水化合物的代谢平衡。AMPK最重要的亚基是γ亚基，因为它是体内AMPK水平的传感器[5]。γ亚基则由 1 个与β亚单位互相结合的结合域和 4个胱硫醚-β-合成酶(CBS)串联重复序列组成的两个贝特曼域(betaman domain) 组成[6]。

图1 AMPK结构模式图Fig.1 The structure of AMPK

1.2 AMPK的生理调控机制

AMPK作为能量调节器，参与多种代谢活动，其活性调节涉及复杂的信号通路和调控机制。目前认为AMPK的活性主要受细胞中AMP/ATP比率的调节，AMP/ATP比率升高，则AMPK被激活[7]。

AMPK可以被一些上游的AMPK激酶，如丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(LKB1)、转化生长因子活化激酶-1(TKA1)、钙调蛋白激酶激酶(CaMKKS)直接激活。它们都是通过直接磷酸化AMPKα亚单位上的Thr-172而激活AMPK[8]。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(LKB-1)是最主要的AMPK上游调节激酶，体内外实验均证实LKB-1可以直接使Thr172磷酸化，但是它发挥作用需要依赖STRAD-M025复合物[5]。

研究表明，无论LKB-1还是CaMKKS，它们均不能被腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)直接激活，只有在细胞内Ca离子水平增加后才能被激活。研究发现，在大脑内，CaMKKS激活AMPK被认为是最重要的方式。作为一种可被选择的激酶，TKA1可使骨骼肌激活，它在心脏内AMPK的激活作用中也发挥重要作用[5]。

2 AMPK与成骨细胞功能

2.1 AMPK与NADPH

还原型辅酶Ⅱ(NADPH)是一种辅酶，在成骨细胞中起递氢体的作用，参与多种合成代谢反应。Jeon[9]的研究表明，AMPK在NADPH的代谢中发挥重要作用，其中AMPK/ACC(腺苷酸激活蛋白激酶/乙酰辅酶 A 羧化酶)信号轴在维持NADPH的代谢平衡中发挥作用。激活AMPK可以减少活性氧的积累，从而减轻氧化应激的作用，并通过增加NADPH的活力，主要是增加NADPH的合成以及限制NADPH的分解，最终达到保护细胞免受氧化应激的破坏[10]。

Guo等[11]研究发现，使用Compound13(一种小分子的AMPK激活剂)可以激活依赖AMPK的NADPH信号通路，它可以抑制地塞米松产生活性氧，同时Compound13可以增加培养的鼠MC3T3-E1细胞的NADPH活力。但是假如使AMPK基因突变或将此基因敲除后，这种增强NADPH活力的作用将会受到抑制。这个实验结果表明，Compound13激活AMPK，通过增加NADPH数量，从而抑制地塞米松产生的氧化应激对培养的成骨细胞的破坏作用。

She等人[12]的研究发现，使用AMPK的抑制剂CompoundC或敲除基因后，可以显著增加过氧化氢处理过的MG63细胞所产生的氧化应激，同时他们观察到细胞内高的NADPH+与NADPH之间的比例，显示过氧化氢处理过的MG63细胞内产生更多的NADPH消耗。由以上实验可以得出，激活AMPK后可以通过减少氧化应激条件下成骨细胞内NADPH的消耗，而起到抗氧化的作用。

2.2 AMPK与成骨细胞自噬

自噬(autophagy)是以自噬体的出现为特征，对细胞内环境的稳态和细胞生存至关重要，当细胞在缺乏营养或发生应激反应时，可诱发自噬现象[13]。将细胞暴露在应激条件下将产生自噬，它可以使细胞在氧化条件下或营养/生长缺乏的条件下生存。

最新的研究表明，AMPK是自噬活动的一个关键调节者。事实上，一方面AMPK可以通过自身磷酸化及刺激UK1而直接引起自噬；另一方面，调节mToRc1(雷帕霉素靶蛋白的复合体)而抑制其发挥作用可间接产生自噬；再者，Lc3B-1(微管相关蛋白轻链3B)在自噬形成过程中也起重要作用，通过类泛素系统，Lc3B-1经脂化作用转变为Lc3B-2引起自噬[12]。

She等人[12]的研究发现，经过氧化氢培养的MG63细胞可以产生UK1的磷酸化、mToRc1被抑制以及Lc3B-1通过脂化作用转变为Lc3B-2，引起Lc3B-2的上调。这些实验数据都显示成骨细胞自噬活动的发生。进一步研究发现，使用自噬抑制剂3-MA及bafilo myciaAI后，可以破坏过氧化氢作用下细胞自噬活动的产生；另外，将AMPKα基因敲除后，也可以抑制成骨细胞内自噬活动的产生。通过这些实验，可以推测在氧化应激条件下，AMPK被激活后，它可以增加成骨细胞内自噬活动，最终达到保护成骨细胞的作用。

2.3 AMPK与成骨细胞凋亡

细胞凋亡(apotosis)是细胞受基因调控而发生的一种主动的程序化死亡过程，对维持机体内环境稳定具有重要的生物学意义。成骨细胞凋亡是骨组织发生、发育、修复等过程中的一种重要的调节机制，它在维持成骨细胞的数目及功能方面具有重要的作用[14]。大量的体内外实验证实成骨细胞凋亡在骨丢失的病理过程中影响深远，之前的研究还证实成骨细胞凋亡与骨密度的减少相关。

Zhu等人[15]的研究发现，使用浓度为10mM的A-769662(AMPK的激活剂)试剂将人MG-63细胞预处理1h后，再将其放在过氧化氢溶液中处理，培养48h后，使用FACS和ELISA检测发现，过氧化氢产生的多聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶(PARP)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)清除量减少，在氧化应激条件下，PARP可作为细胞内有效监测DNA损伤的分子感受器，参与修复损伤或诱导细胞凋亡[16]；Caspase-3 是参与凋亡级链反应最终效应子， 是细胞凋亡的真正执行者，也被称为“死亡蛋白酶”。激活后的Caspase-3 引导下游其他一系列Caspase 蛋白激活，从而导致细胞凋亡[17]。这两种酶的清除量减少表明A-769662试剂可以抑制过氧化氢产生成骨细胞凋亡，使用AMPK的抑制剂CompoundC或用shRNA将AMPK基因沉默，均可加速过氧化氢产生的成骨细胞凋亡，表明A-769662试剂的细胞保护作用随着AMPK被抑制或作用减弱而减少。

在另外一项实验中，实验者使用AMPK的抑制剂CompoundC去阻碍AMPK激活，结果显示，使用了抑制剂后，过氧化氢处理过的成骨MG63细胞凋亡数量增加，然后他们使用AMPKα基因被沉默的MG63细胞观察，结果发现过氧化氢处理过的成骨细胞凋亡数量显著增加[12]。以上结果表明，AMPK抗氧化作用是通过减少成骨细胞凋亡而达到的。

2.4 AMPK与成骨细胞内ATP

最新的研究表明，几乎所有的真核细胞在应激条件下(包括缺氧或缺乏能量的状态)，将会导致ATP的数量减少，进而出现AMP/ATP的比率增加，从而激活AMPK，而激活AMPK可以提高维持体内ATP的内稳态的能力以提高细胞生存。

Yang等[10]的实验发现，地塞米松处理过的MC3T3-E1细胞，ATP的数量是减少的，使用氧化剂NaHS(H2S的供体，大量实验证明H2S有抗氧化的功能)可以抑制ATP减少；当使用AMPK抑制剂后，NaSH对ATP数量的影响作用将会减弱。进一步研究表明NaHS抑制地塞米松产生ATP消耗，AMPK的激活在这个过程中起重要作用。

Zhu等人[15]的研究发现，MG-63或MC3T3-E1细胞经过氧化氢处理后，ATP的数量都减少了，但使用AMPK的激活剂A-769662处理后成骨细胞内ATP数量有所增加，当他们使用AMPK抑制剂CompoundC后，ATP数量将会减少。通过以上实验可以认为由于过氧化氢处理后的成骨细胞将会导致ATP数量下降，这会刺激AMPK，导致AMPK被激活，通过体内调节以维持成骨细胞内ATP水平，从而达到保护成细胞免受氧化应激损害的目的。

3 AMPK激活作为骨质疏松治疗的通路

AMPK激活后可以通过以上各种方式影响成骨细胞，进而保护成骨细胞免受氧化应激的作用，这些方式不是孤立存在的，它们之间是相互联系的。激活AMPK可能是这样保护成骨细胞免受氧化应激的损害：AMPK被激活后通过提高NADPH的合成及减少其消耗，调节ATP的体内平衡，激活自噬活动等这些途径共同达到抑制过氧化氢产生成骨细胞凋亡。

综上所述，骨质疏松作为一种多病因的慢性代谢性疾病，与多种因素相关，这些因素可以通过氧化应激这条共有的机制来影响成骨细胞的功能。氧化应激在骨质疏松症中发挥重要作用，过多的ROS通过影响多种细胞因子或酶活性来调控多条信号通路，最终影响成骨细胞的功能，打破以破骨细胞和成骨细胞之间的动态平衡，从而促使骨质疏松症的产生，进而影响骨代谢。目前的文献没有对其相关联的通路有一个系统且清晰的概括。因此，有必要对通路进行深入研究，便于更好地指导骨质疏松新药的研发[18]。

激活AMPK作为其中的一种重要调节机制，可以影响成骨细胞在氧化应激条件下NADPH的合成、ATP的代谢、细胞凋亡、细胞自噬等活动。通过激活AMPK，可以增加成骨细胞活力，进而影响骨代谢平衡，为骨质疏松的治疗提出理论依据。