卢严方 林贯川 刘倩倩 刘梦宜 马文丽 潘星华

南方医科大学基础医学院，广东 广州 510515

六味地黄丸是宋代钱乙创制的滋阴补肾的方剂，由熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻组成，为补益剂，具有滋阴补肾之功效。现代药理研究也已证实六味地黄方剂具有治疗骨质疏松、增强免疫功能、抵抗衰老病症及其他功效[1-2]。

随着中药现代化的不断推进和基因芯片的广泛应用，在中医药治疗疾病方面产生了大量的基因芯片数据，然而由于数据分析技术的局限性，大量的数据并没有得到充分的利用，因此本研究针对美国国家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)上六味地黄丸治疗骨质疏松症方面的功效相关数据集进行基因表达谱差异及其相关功能机制的分析。

1 材料与方法

1.1 GEO数据集

本研究所采用的与六味地黄丸相关的基因表达谱数据(登录号为GSE57273)，是从NCBI数据库GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载，在GEO Series数据库搜索框中以“Liuwei Dihuang Pill”为检索词，获得由Xie等人提交的芯片数据GSE57273。GSE57273所用的实验平台是Agilent公司的014850人类全基因组芯片4x44K G4112F(特征数版)，采取患者骨外周血进行芯片检测，共有3例患者，6个样本，其中六味地黄丸治疗绝经期肾阴虚骨质疏松症前样本数为3个(对照组)，治疗3个月后样本数为3个(实验组)。生物芯片检测对组织样本数的最低要求为3个，3个就已经达到生物学重复，有统计学意义。此数据样本病例的纳入标准和排除标准以及合并用药均有严格详细的规范[3]。

1.2 分析工具

1.2.1数据处理和差异基因分析：Qlucore Omics Explorer3.0(http://www.qlucore.se/)可用于分析基因芯片、miRNA芯片、甲基化芯片和蛋白质芯片，该软件功能全面，操作简便。本研究利用Qlucore Omics Explorer3.0软件对芯片数据进行统计学分析，先将数据集导入Qlucore Omics Explorer3.0软件，进行标准化处理(平均数为0，标准差为1)，采用Two Group Comparsion(两组样本T检验)统计分析方法，对数据进行有效过滤，从而筛选出差异基因[4]。

1.2.2差异基因的GO富集分析和通路分析：生物学信息注释数据库(the database for annotation，visualization and integrated discovery，DAVID)为大规模的基因或蛋白列表提供系统综合的生物功能注释信息，能够找出最显著富集的生物学注释。本研究是将筛选出的差异基因上传至DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)在线软件，选择DAVID软件中的基因功能注释聚类分析(Functional Annotation Clustering)，对这些差异基因进行生物学通路、分子功能、生物学过程预测分析[5-6]。

1.2.3差异基因编码蛋白的相互作用分析：蛋白质相互作用关系数据库(functional protein association networks，STRING)，包含了来自2031种生物的9643763种蛋白质，是最大的蛋白质数据库之一，通过STRING在线分析工具，可以直接或间接地预测蛋白质之间的关系。将差异基因导入STRING(http://string-db.org/)分析工具，分析其所编码的蛋白质之间的相互作用联系图，找出处在关键节点的蛋白质[7-8]。

2 结果

2.1 六味地黄丸对绝经期骨质疏松症治疗前后的差异基因分析

通过QOE软件导入GSE57273数据集进行主成分分析，在没有经过筛选处理之前，可以看到在动态PCA图中显示(见图1)数据样品之间的分布变异很大，表明数据集中的基因需要进行进一步的标准化处理。

图1 GSE57273筛选前两组原始动态PCA图Fig.1 The picture of original dynamic PCA in two groups before GSE57273 screening

由图1可以看到两组数据分组，蓝色为六味地黄丸治疗绝经期肾阴虚骨质疏松症前的样品芯片数据，黄色为六味地黄丸治疗绝经期肾阴虚骨质疏松症之后的芯片数据。但是两组数据相当分散，变异较大，此时基因总变量为19136个基因。

随后，对数据进行标准化处理，使mean=0，variance=1，然后筛选差异基因(如图2)，此时不同样品对之间变异缩小，六味地黄丸治疗组和未治疗组能够完全分开并各自聚集。此时筛选条件为：P=1.4814e-5<0.05，Fold Change=2，Q=0.003<0.01，差异具有统计学意义。

图2 GSE57273筛选后两组的动态PCA图Fig.2 The picture of original dynamic PCA in two groups after GSE57273 screening

由图2可以看出，蓝色点(治疗前)和黄色点(治疗后)已经完全分开。表明六味地黄丸治疗绝经期肾阴虚骨质疏松症前后确实存在着基因差异。此时筛选出的差异基因有97个。

将这些筛选出的差异基因经热图(见图3)分析之后显示出治疗后上调基因有2个，分别是TNP1和MAP3K10，下调基因有95个。

图3 筛选的差异基因热图Fig.3 The heat map of screened differential gene

2.2 差异基因的功能聚类(DAVID)分析

为了验证筛选出的97个差异基因参与的主要生物学功能，笔者将97个差异基因导入到DAVID中得到如表1所示的基因功能富集类型。

2.3 差异基因蛋白质相互关系网络图(STRING)分析

为了解97个差异基因所编码蛋白质相互关系的网状结构，笔者把97个差异基因进行了STRING分析，其中STRING识别出的差异基因为88个，得到如图4所示的蛋白质相互作用网络图。

由图4可以看出，在可识别的88个差异基因中，可以发现蛋白质网络图中多数基因之间相互比较孤立，但是以XRN1为中心的ZNF家族基因(ZNF292、ZNF131、ZNF808、ZNF85、ZNF430、ZNF813、ZNF25、ZNF709、ZNF727)、XPO1、PPP1R8、LSM14A联系密切(Connection score>0.400，表明所分析蛋白相互作用可信度在中等以上)。由差异基因表达热图(图3)中可以发现在筛选出的差异基因中只有TNP1和MAP3K10两个基因在经过六味地黄丸治疗后表达上调，其他基因则全部表达下调，表明这两个基因在六味地黄丸治疗绝经期肾阴虚骨质疏松症中可能起着关键作用。经过系列分析，笔者可以初步说明六味地黄丸影响绝经期肾阴虚骨质疏松症治疗作用的分子机制主要集中在这6个基因以及ZNF家族基因上。

表1 根据富集系数筛选出的六味地黄丸治疗前后差异基因功能富集表Table 1 The function enrichment of screened differential genes before and after rehmanniae bolus treatment according to enrichment score

图4 差异基因的蛋白质相互作用网络图Fig.4 Differential genes in protein interaction networks

2.4 数据挖掘和分析

绝经后骨质疏松肾阴虚证是目前老年妇女的常见病，严重影响着老年妇女的身体健康，其发病机理涉及到骨形成与吸收、激素合成、免疫调节、矿物质吸收、鞘磷脂代谢、蛋白质消化吸收等生物学过程。本文着重就六味地黄丸治疗绝经后骨质疏松肾阴虚证中的骨形成与吸收、激素合成、免疫调节3个方面生物学过程进行相关分子机制的探讨。

2.4.1促进骨的形成：雌激素是女性最为重要的性激素之一，具有促进骨形成与抑制骨吸收的作用，对维持骨密度、提高骨量具有促进作用，绝经后骨质疏松肾阴虚证的发生与骨形成的减少和骨吸收的增加密不可分[9]。采用六味地黄丸治疗后，从差异基因的蛋白质相互作用网路图中可以发现，节点度最高的基因是XRN1基因，与其密切相关的则是ZNF家族基因(ZNF292、ZNF131、ZNF808、ZNF85、ZNF430、ZNF813、ZNF25、ZNF709、ZNF727)。ZNF家族基因在细胞中具有许多重要的功能，其最为重要的作用是转录调控。笔者发现经筛选出的ZNF家族基因在六味地黄丸治疗后全部都是低表达的，而ZNF131基因则是雌激素受体α(ERα)的抑制因子，并且是BTB/POZ转录因子家族的典型成员，它在细胞内普遍表达并具有高度的序列保守性。研究表明ZNF131能够阻止甚至阻断ERα结合雌激素效应元件(ERE)，另外ZNF131也能够抑制ERα靶基因pS2的表达[10-13]。因此笔者推断六味地黄丸治疗绝经后骨质疏松症肾阴虚证的分子机制可能是通过降低ZNF131基因的表达，减少ZNF131对雌激素受体的抑制作用，从而增加雌激素和雌激素受体(ERα)的结合，使得成骨细胞活性增加，破骨细胞活性降低，促进骨的形成并抑制骨的吸收。同时，XRN1基因目前已被证实是抑制骨肉瘤的关键基因，而骨肉瘤产生的机制就是瘤细胞直接产生肿瘤骨或骨样组织。由热图中可以看到XRN1基因在六味地黄丸治疗之后是低表达的，因此笔者推测六味地黄丸治疗绝经后骨质疏松症肾阴虚证在骨形成方面的另一分子机制是通过降低ZNF家族基因的表达来调控降低成骨细胞中XRN1基因的表达，从而使得成骨细胞更多的转化为骨质，达到缓解治疗绝经后骨质疏松症肾阴虚证的作用[13]。

2.4.2促进雌激素与雌激素受体的结合：性激素能参与骨代谢，其中雄激素主要是间接合成蛋白质，促进骨内胶原形成，进而促使钙、磷等在骨内沉积。Schweik-ert等指出每个正常男性或女性的骨细胞内含(821±140)个分子的雄激素受体，骨细胞中有雄激素受体(AR)基因转录的mRNA，并且能表达AR蛋白质，证明雄激素对骨细胞的作用是直接的[14-15]。同样，雌激素也能参与骨的代谢。女性绝经后卵巢分泌雌激素功能减退，但卵巢间质可分泌雄激素，雄激素在外周可通过芳香化酶的作用转化为雌酮，成为此时血循环中的主要雌激素[16]。

在热图中可以看到所筛选出来的差异基因TNP1在治疗后是高表达的(图3)，由功能通路富集表可知TNP1参与广泛的生物学过程(调控转录、调控核酸代谢、正调控分子功能、调控细胞内信号通路以及调控细胞凋亡等)。研究表明TNP1基因与雌激素受体具有显著的正相关性。因此六味地黄丸治疗绝经后骨质疏松症肾阴虚证的另一分子机制可能是通过调控TNP1的表达来增强雌激素受体与雌激素的结合，进而增加雌激素的生物利用度治疗绝经后骨质疏松肾阴虚证[17-18]。

2.4.3增强免疫调节：骨免疫学认为免疫系统和免疫因素的调节对骨质疏松的发展起着重要作用，同时免疫细胞和骨细胞间的对话也为揭示性激素和炎症通过调节T淋巴细胞功能导致骨丢失机制创造了机遇[19-21]。最近人们认识到，T淋巴细胞可调节成骨细胞和破骨细胞的生成、代谢和活性，T细胞分泌的多种细胞因子可抑制成骨细胞的分化并抑制其凋亡，而性激素的老化和减少可影响免疫系统和T细胞；另外T细胞可能具有直接作用于破骨前体细胞从而诱导破骨细胞分化的能力[22]。绝经后妇女卵巢功能减退，雌激素水平下降，促进T细胞的激活和增殖，引起体内免疫应答因子的变化，抑制成骨细胞的产生，促进破骨细胞的生成并抑制其凋亡，骨吸收超过骨形成，导致骨偶联失衡，引发骨重建失衡，最终引起骨质疏松症的发生[23-25]。

另外，在筛选出来的差异基因中另一个高表达基因是MAP3K10，即丝裂原活化蛋白激酶10。MAP3K10基因参与广泛的生物学过程，其中尤为重要的一点是参与调节细胞内的核酸转录，能够调节核酸代谢和细胞凋亡[26-27]。而在蛋白质网络图中与XRN1基因联系密切的XPO1基因则是参与细胞周期调控的基因，同时与XPO1基因联系密切的NUP54基因是一个蛋白编码基因，其相关通路与免疫系统密切相关[28-29]。因此六味地黄丸治疗绝经期肾阴虚骨质疏松症在免疫调节上的分子机制可能是通过上调MAP3K10基因的同时下调XPO1基因，进而使得NUP54基因表达降低，引起免疫应答减弱，减少T细胞的活化，促进成骨细胞的生成，抑制破骨细胞的合成并促进其凋亡，达到治疗绝经期肾阴虚骨质疏松症的目的。

3 结论

六味地黄丸作为中成药的代表之一，其对人体的功效正在被不断地挖掘发现。本文针对六味地黄丸对绝经期肾阴虚骨质疏松症的功效在基因层面上作了一系列的数据挖掘分析，旨在得到六味地黄丸治疗骨质疏松的相关靶基因和调控机制，分析结果显示其在基因调控上主要是通过下调XRN1基因和ZNF家族基因的表达促进雌激素的分泌和上调MAP3K10基因的表达并下调XPO1基因和NUP54基因的表达来平衡免疫应答从而促进骨组织的形成。另外，上调TNP1基因的表达促进雌激素与雌激素受体结合，提高雌激素的生物利用度，达到治疗缓解绝经期肾阴虚骨质疏松症的目的，本研究在分子层面上为今后骨质疏松症的临床治疗起到了一定的指导作用。