吉璐宏 赵庭波

仙桃市第一人民医院骨外二科，湖北 仙桃 433000

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种以骨量减少、骨组织微结构被破坏为特征的全身性骨骼代谢障碍性疾病，并容易发生脆性骨折[1]。据统计，我国60岁以上的人群其骨质疏松症的发病率高达59%[2]，随着我国人口老龄化进程的加快，骨质疏松患者将会越来越多[3]，这使得骨质疏松已成为一个社会性的健康问题。

在正常的情况下，骨组织和其他组织一样有着稳定的代谢平衡，骨吸收与骨形成的速度大致相等，处于一个平衡状态。然而，随着年龄的增加造成生理性退化，使得这种平衡被打破，骨的吸收速度大于骨的形成，从而导致了骨质疏松[4]。因此，抑制破骨细胞的骨吸收和促进成骨细胞的骨形成是治疗骨质疏松的两种有效方法[5]。目前临床上却是以抗骨吸收类药物为主，如双膦酸盐、选择性雌激素受体调节剂等，虽然这些抗骨吸收类药物能够有效地防止骨骼进一步流失，但对增加骨的形成作用却甚微。令人遗憾的是，具有促进骨形成作用的药物却只有甲状旁腺激素(PTH-1)，而该药物却会增加患者患骨肉瘤发病率的风险[6]。因此，开发出新型、高效、低毒的促骨形成类药物对治疗骨质疏松有着重要意义。研究表明肠源性的血清素能够抑制成骨细胞的分化、减少骨形成，而色氨酸羟化酶-1(TPH-1)是肠源性的血清素合成的限速酶，因此可以通过抑制TPH-1来调节血清素的合成能够促进骨形成，达到治疗骨质疏松的目的[7-9]。

五环三萜类化合物是一类在自然界中广泛存在的天然产物，具有多种药理活性如抗癌[10-11]、抗炎[12-13]、降血糖[14]等，且毒性低、不良反应少，具有良好的临床开发潜力。最近研究表明五环三萜类化合物齐墩果酸(OA，图1)也具有较好的抗骨质疏松的活性[15-16]，因此本研究继续探讨五环三萜其他类型化合物熊果酸(UA)、18β-甘草次酸(GA)、商陆酸(EA)、3-乙酰氧基-11-羰基-β-乳香酸(AKBA)、积雪草酸(AA)、雷公藤酮(TO)、白桦酸(BA)的促骨形成活性，以期得到抗骨质疏松活性更强、毒性更低的五环三萜类先导化合物。结果表明，测试的五环三萜类化合物对肠源血清素均有抑制作用，其中18β-甘草次酸展现出了最强的活性，并能显著地促进成骨细胞增殖。

图1 五环三萜类化合物的化学结构Fig.1 Structure of pentacyclic triterpenes

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1试剂和细胞：五环三萜类化合物均购自北京百灵威科技有限公司，DMEM培养基、α-MEM培养基、胎牛血清购自Hyclone公司；色氨酸羟化酶-1 (TPH-1)ELISA试剂盒购自Cusabio公司；5-羟色胺 (5-HT)标准品购自上海上海生物科技有限公司；二甲基亚砜等其他试剂均为分析纯；RBL-2H3细胞株购自上海细胞典藏中心，本实验室冻存使用。动物：SD大鼠，体重200～250 g，雌性，由武汉大学实验动物中心提供，动物使用许可证号：SCXK (鄂) 2008-0004；动物级别：SPF级。

1.1.2仪器：Agilent1200高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；FA1104N型电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)；BB16/BB5060仪器CO2培养箱(上海力创科学仪器有限公司)；超净工作台(北京半导体设备一厂)；CKX31型倒置显微镜(奥林巴斯公司)；ELx800通用酶标仪(美国BioTek公司)。

1.2 方法

1.2.1肠源性血清素合成抑制测试：首先用HPLC对血清素(5-羟色胺，5-HT)标准品进行分析，确定其保留时间。5-HT的抑制率通过积分所得面积比，计算公式为：抑制率(%)=100% -测试化合物峰面积/对照组峰面积。取对数生长期的RBL-2H3细胞株悬浮于含10%胎牛血清DMEM培养基中，铺至48孔细胞培养板中。待细胞完全贴壁后，弃去原培养液，加入200 μL的含有测试药物(对照组不加药物)的培养液培养2d后，弃去培养液，并用PBS洗涤，然后每孔加入100 μL 强裂解液RIPA裂解细胞，在加入200 μL PBS稀释，离心后直接用HPLC测定5-HT的峰面积，并计算出药物的对5-HT生物合成的抑制率。

1.2.2三萜类化合物对RBL-2H3细胞毒性的MTT检测：为了进一步确证三萜类化合物是否因其内在毒性也影响血清素合成，接着采用MTT法测试三萜类化合物对RBL-2H3细胞的毒性。取对数生长期的测试细胞株悬浮于含10%的胎牛血清的DMEM培养基中，铺至96孔细胞培养板中。待细胞完全贴壁后，弃去原培养液，加入100 μL的含有测试药物的培养液培养2d后，每孔加入30 μL 5mg/mL MTT，置于37 ℃、5% CO2培养箱中继续孵育4 h，然后每孔加入100 μL二甲亚砜(DMSO)溶解。使用酶标仪在570 nm波长处测定每孔的吸光度(OD)值。

1.2.3三萜类化合物对TPH-1蛋白量的影响：用ELISA试剂盒，绘制TPH-1蛋白量-吸光度的标准曲线，再通过测试三萜类化合物与RBL-2H3细胞相互作用后的吸光度值计算出不同浓度三萜类化合物对应的TPH-1蛋白量，从而确定化合物对TPH-1蛋白量的影响。取对数生长期的RBL-2H3细胞株悬浮于含10%胎牛血清DMEM培养基中，铺至24孔细胞培养板中。待细胞完全贴壁后，弃去原培养液，加入500 μL的含有测试药物(对照组不加药物)的培养液培养2 d后，弃去培养液，并用PBS洗涤，然后将细胞反复的冻融，收集裂解液用ELISA试剂盒测试，使用酶标仪在450 nm波长处测定每孔的吸光度(OD)值。

1.2.4三萜类化合物对TPH-1基因表达的影响：(1)总RNA提取：取对数生长期的RBL-2H3细胞株悬浮于含10%胎牛血清DMEM培养基中，铺至6孔细胞培养板中。待细胞完全贴壁后，加入不同浓度测试药物(对照组不加药物)的培养液培养2d后弃去原培养液，每孔加入1 mL Trizol试剂，吹打细胞，使细胞充分裂解；随后，加入0.2 mL氯仿，室温静置5 min后离心15 min，将上层水相移置另一个1.5 mL无RNA酶的离心管中，并加入预冷的异丙醇(0.5 mL)沉淀RNA，离心后弃上清液，加入1 mL 75%的乙醇(0.1%DEPC水现配现用)，用移液器吹打乙醇，洗涤RNA沉淀，离心后弃上清液，将离心管倒置，室温晾10 min后加入80 μL DEPC水溶解RNA。使用紫外分光光度计检测RNA浓度值及OD260/OD280值，-80 ℃冰箱保存。(2)实时荧光定量PCR：首先登录GenBank database和文献查寻TPH-1基因序列[17]，并确定所用引物序列为5′-GAAGACGTGGGGAGTTGTGT-3′，5′-ACAGTGGAAA ACACGGAAGG-3′；接着以RNA为模板反转录出第一条cDNA链(5PrimeScriptTMBuffer (for Real Time) 2 μL；PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I 0.5μL；Oligo dT Primer (50 μmol/L) 0.5μL；Random 6 mers (100 μmol/L) 2 μL；Total RNA 500 ng；补加Rnase Free dH2O水至10 μL。设定程序为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 5 min)。随后以cDNA为模板进行Real-Time PCR (SYBR Premix Ex TaqTMII 10 μL；PCR Forward Primer (10 μmol/L) 0.8 μL；PCR Reverse Primer (10 μmol/L) 0.8 μL；ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL；DNA 模板 2 μL；ddH2O 6 μL。设定程序为95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，进行40个循环，95 ℃ 20 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s)。

1.2.5体内抑制血清素的合成测试：将11w大的雌鼠分为给药组[10 mg/(kg·d)组、20 mg/(kg·d)组、30 mg/(kg·d)组]、空白组和假手术组，每组5只。在摘除卵巢造模术后第4天开始灌胃给药[阳性对照组腹腔注射20 mg/(kg·d)的PTH]，连续给药35d后颈动脉取血。将血液在37 ℃下静置45min后得到的血清用HPLC(104.6 mm，5μm C18柱)测试其血清素的含量；小肠则在酸化后测试其血清素，并用标准曲线定量。

1.2.6促进骨细胞增殖：将20只出生2～3d的乳小鼠断头处死，取出其头盖并刮去软组织，放入10 mL 成骨细胞消化液中(0.1% collagenase+0.2% dispase+0.01M PBS+15%FBS的α-MEM培养基配置而成)，37 ℃消化15 min后取上清液，并于2000 rpm离心5 min收集细胞；随后，将收集到的细胞接种到培养瓶中培养4d，洗去为贴壁的细胞，剩下的细胞即为成骨细胞；接着，取对数生长期的测试细胞株悬浮于含15%胎牛血清的α-MEM培养基中，铺至96孔细胞培养板中。待细胞完全贴壁后，弃去原培养液，加入100 μL的含有测试药物的培养液培养2d后，每孔加入30 μL 5mg/mL MTT，置于37 ℃、5%CO2培养箱中继续孵育4 h，然后每孔加入100 μL二甲亚砜(DMSO)溶解。使用酶标仪在570 nm波长测定每孔的吸光度(OD)值。

2 结果

2.1 体外抑制血清素合成

肠源性血清素主要由TPH-1合成，因此血清素的水平变化是TPH-1活性的重要指标。利用RBL-2H3(表达TPH-1)细胞来评价三萜类化合物抑制血清素的能力，结果如图2所示。

图2 五环三萜类化合物抑制肠源性血清素的合成作用Fig.2 Inhibitory effects of pentacyclic triterpeneson on serotonin biosynthesis

图4 GA对TPH-1蛋白量的影响。A：TPH-1含量的标准曲线；B：GA在RBL2H3细胞中对TPH-1蛋白量的影响。每组数据都是 Fig.4 Effect of GA on the protein expression. (A) Standard curve for ELISA determination of TPH-1; (B) Effects of GA on the protein expression of TPH-1 in RBL-2H3 cells. Each value was expressed as means ± SD, n=4, *P< 0.01, **P< 0.05 vs controls (Con.)

2.2 体外抑制血清素合成的抑制活性

研究发现这些五环三萜类化合物对血清素均有一定程度的抑制作用，考虑到这些三萜类化合物有可能是通过其内在的毒性杀伤细胞而抑制血清素的合成，因此采用MTT法测试了这类化合物的毒性，其结果如图3所示。

图3 五环三萜类化合物对RBL-2H3细胞的毒性 Fig.3 Cytotoxicity of pentacyclic triterpenes on RBL-2H3 cells

2.3 18β-甘草次酸(GA)对TPH-1蛋白量的影响

通过体外活性实验(图2、3)表明，18β-甘草次酸(GA)能够显著地抑制血清素的合成，为了进一步确证GA对TPH-1蛋白的影响，采用了ELISA试剂盒检测了GA在RBL-2H3细胞中对TPH-1蛋白量的影响，TPH-1蛋白量-吸光度的标准曲线和GA对TPH-1蛋白量的实验结果如图4所示。

2.4 18β-甘草次酸(GA)对TPH-1 mRNA表达的影响

通过体外活性实验(图4)表明，18β-甘草次酸(GA)能够显著影响RBL-2H3细胞中TPH-1蛋白量并呈剂量依赖关系。为了一步研究GA对TPH-1mRNA表达的直接影响，应用实时荧光定量GA对TPH-1 mRNA表达影响，其结果如图5所示。

图5 GA对TPH-1 m RNA表达的影响，对照组加入0.1% DSMO，数据表示倍数变化。每组数据都是 vs Controls (Con.) Fig.5 Effect of GA on the mRNA expression. Control group was treated with 0.1% of DMSO, and the data were expressed as a fold change. Each value was expressed as means ± SD, n=4, *P<0.01,**P<0.05 vs controls (Con.)

2.5 18β-甘草次酸 (GA)对OVX大鼠血清和肠中血清素的影响

体外活性测试表明GA能够抑制血清素的合成，并且没有毒性，为了进一步研究GA在动物体内是否也能够有效地抑制血清素的合成，笔者采用了大鼠摘除卵巢(ovariectomized， OVX)的动物模型进行研究。灌胃给予摘除卵巢大鼠不同剂量的GA。实验结束后用HPLC测定血清和小肠的血清素水平，标准曲线和实验结果如图6所示。

图6 GA抑制体内血清素的合成。A：5-HT含量的标准曲线；B、C分别为假手术组(Sham)与摘除卵巢大鼠血清和小肠的血清素水平。每组数据都是 Fig.6 Effect of GA on serotonin biosynthesis in vivo. A: Standard curve of 5-HT; B (serum) and C (gut) serotonin levels of Sham-operated and ovariectomized (OVX) rats. Each value was expressed as means ± SD, n=4, #P< 0.05 vs Sham;*P< 0.01, **P< 0.05 vs OVX

2.6 18β-甘草次酸(GA)促进成骨细胞增殖

通过体外和体内研究发现GA能够显著地抑制血清素的合成，接着采用MTT法探讨GA是否能够促成骨细胞的增殖，其结果如图7所示。

图7 GA促进成骨细胞增殖效果。每组数据都是Fig.7 Stimulating effect of GA on osteoblast proliferation. Each value was expressed as means ± SD, n=3,*P< 0.01, **P< 0.05 vs controls (Con.)

3 讨论

骨质疏松症是成骨细胞和破骨细胞之间的动态平衡被打破，骨吸收超过骨形成所致。因此，促进成骨细胞的活性是治疗骨质疏松症的重要方法。本研究以色氨酸羟化酶-1 (TPH-1)为靶点，探讨了具有广泛生物活性的天然五环三萜类化合物对TPH-1的抑制活性以及成骨细胞的活性。从图2肠源性血清素的抑制活性结果中可以看出这些五环三萜类化合物对血清素合成均有抑制作用，抑制率为3.6%～76.5%，并呈剂量依赖关系；但是三萜类化合物之间对血清素合成抑制作用却有较大的差异。从结构上看，这些测试的化合物均是五环结构，但在环上有不同的取代基，正是这些取代基团的不同使得化合物对血清素合成展现出了不同程度的抑制作用；由这些基团与活性之间的关系可以初步得出五环三萜类化合物的构效关系。以齐墩果酸(OA)作为母体化合物，将其D环的一个甲基(-CH3)由C20位转移到C19位(熊果酸，UA)能够保留对血清素合成的抑制活性；进一步在熊果酸的C环引入α,β-不饱和酮(18β-甘草次酸，GA)能够显著地提高其活性，在30 μM的浓度下，GA对血清素的抑制率可达到76.5%；然而，在C3位引入取代基后却降低了活性(OA vs EA；GA vs AKBA；UA vs AA)；同时，将α,β-不饱和酮由C环转移到A环后也降低了活性(GA vs TO)；此外，将D环修由六元环修饰成五元环也将降低活性(OA vs BA；UA vs BA)。这些结果说明C环的α,β-不饱和酮是一个能够抑制血清素合成的药效团。事实上，在五环三萜类化合物的结构修饰中，C环的α,β-不饱和酮也能够增强母体化合物的抗肿瘤、抗炎等活性；进一步研究发现五环三萜类化合物对血清素的抑制活性不是来源于其对RBL-2H3细胞的毒性，而是来源于其对TPH-1的抑制活性(图3)，并能够明显地抑制TPH-1蛋白含量及其mRNA表达，并呈剂量依赖性(图4、5)。在动物水平上，与Sham组相比，OVX组血清和小肠中血清素的水平明显增高，而经过GA给药后大鼠血清和小肠中血清素的水平却明显降低并呈现出剂量依赖性，尤其是在30 μM浓度下血清(426 ng/mL)和小肠(304 ng/mL)中血清素的浓度较OVX组(含量分别为1050 ng/mL和723 ng/mL)降低了大约2.4倍。这些结果说明GA在动物体内也能够抑制血清素的合成(图6)；随后，在促进成骨细胞活性实验中发现，与比空白组相比，GA能够显著地促进乳小鼠成骨细胞增殖，并呈剂量依赖性(图7)。

综上所述，色氨酸羟化酶-1(TPH-1)是治疗骨质疏松症的一个重要靶点，抑制TPH-1能够抑制血清素合成的活性，并能够促进成骨细胞的增殖，而五环三萜类化合物能够有效抑制TPH-1并促进骨细胞的增殖，其中18β-甘草次酸(GA)可以作为治疗骨质疏松症的先导化合物进行更深入的研究。