张文文金玥周金慧

（1中国农业科学院蜜蜂研究所，北京100093；2农业部蜂产品质量监督检验测试中心（北京），100093）

高效液相色谱串联质谱法测定蜂毒中五种生物胺含量

张文文1，2金玥1，2周金慧1，2

（1中国农业科学院蜜蜂研究所，北京100093；2农业部蜂产品质量监督检验测试中心（北京），100093）

开发了一种灵敏准确的测定蜂毒中组织胺、多巴胺、5-羟色胺、肾上腺素和去甲肾上腺素含量的高效液相色谱串联质谱（High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）方法。蜂毒样品用纯水溶解后，离心取上清液，直接上机进行高效液相色谱串联质谱分析。结果表明，蜂毒样品中的五种生物胺在0.5～1000 ng/kg范围内线性良好，R2＞0.998，检测限和定量限范围分别为0.09～0.17 ng/kg和0.30～0.59 ng/ kg，在线性范围内的平均回收率范围为80.9～111.4%，日内RSD＜7.51%，日间RSD＜10.17%。该方法具有良好的精密度和重现性，并且简单快速、绿色环保，适用于蜂毒中生物胺的测定。

蜂毒；生物胺；高效液相色谱串联质谱

蜂毒一种由蜜蜂的毒腺和副毒腺分泌，存储在毒囊中的有毒液体。当处于危险境况中，蜜蜂即会通过毒针将蜂毒液射入人体或者捕食者体内，这种毒液很容易使人体产生过敏反应，严重时危及生命[1]。蜂毒含有活性酶、多肽、碳水化合物、脂质、氨基酸和胺类等多种活性化合物[2]，因此具有抗癌[3]、防辐射[4]、抗菌[5]、消炎[6]和抗突变[7]等多种药理学性质和生物活性。传统中医中，人们成功地使用蜂毒疗法减轻由类风湿、多发性硬化症关节炎关节等引起的慢性疼痛。近几年，关于蜂毒能够阻碍白细胞迁移从而抑制局部炎症，抑制肿瘤细胞的增殖，促进肾上腺皮质激素分泌和改善微循环的集体效应已被发现，因此蜂毒已被广泛用于某些免疫相关疾病、肿瘤、肌肉骨骼疼痛等疼痛疾病的治疗。

组织胺（histamine，His）、多巴胺（dopamine，DA）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、肾上腺素（adrenaline，E）和去甲肾上腺素（noradrenaline，NE）等生物胺是蜂毒中一类重要化合物。组织胺大部分由组氨酸在肥大细胞中脱羧形成，参与中枢和外周神经系统的多种生理功能[8]。多巴胺在脑部分泌，在下丘脑和垂体部位发挥作用，是一种神经递质[9]。90%以上的5-羟色胺由肠嗜铬细胞释放，是一种强力的血管收缩剂和平滑肌兴奋剂[10]。组织胺、多巴胺和5-羟色胺分别在中枢神经系统和周边神经系统中负责不同部门的工作，并且在抑郁症治疗中发挥关键作用。肾上腺素和去甲肾上腺素在肾上腺髓质中合成，肾上腺素去甲基化后形成去甲肾上腺素，在缓解频率心动过缓，低血压和呼气性呼吸困难中起到协同作用[11]。

与蜂毒肽或酶的含量相比，蜂毒中生物胺的含量相对低[12]。但是，在蜂毒摄入人体时所引起的疼痛、瘙痒和过敏等反应却与这类低含量小分子含氮化合物密切相关[13-14]，然而，关于蜂毒中生物胺含量的测定目前尚无研究，因此本研究第一次探索对蜂毒中的组织胺、多巴胺、5-羟色胺、肾上腺素和去甲肾上腺素进行测定。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

组织胺（CAS：51-45-6，纯度＞99.9%）、多巴胺（CAS：51-61-6，纯度＞99.9%）、5-羟色胺（CAS：50-67-9，纯度＞99.9%）、肾上腺素（CAS：51-43-4，纯度＞99.9%）、去甲肾上腺素（CAS：51-40-1，纯度＞99.9%），均购于Sigma公司；甲醇（色谱级）、乙腈（色谱级），购于Fisher Scientific公司；超纯水。

Agilent 1290高效液相色谱仪（美国Agilent公司），6495三重四级杆串联质谱仪（美国Agilent公司），Milli-Q纯水发生器（美国Millipore公司），G560E涡旋混匀器（美国Scientific Industries公司），CR22G高速冷冻离心机（日本日立公司）。

1000 μg/ml标准溶液配制：准确称取5种生物胺标准品10.0 mg，分别溶于10.0 ml色谱纯甲醇中，定容至10 ml，得到浓度为1000 μg/ml的标准储备液，该溶液在4℃冰箱中避光可保存6个月。

标准工作液配制：通过使用纯水系列稀释1000 μg/ml标准储备溶液，获得五种生物胺的0.5 ng/ml，5.0 ng/ml，25 ng/ml，100 ng/ml，500 ng/ml和1000 ng/ml标准工作溶液和混合标准工作溶液。

1.2 方法

1.2.1 样品采集与制备

蜂毒样品采用电击法获得，每隔一周采用轻度电脉冲冲击刺激蜜蜂，使蜜蜂释放毒液到蜂毒采集装置玻璃板上，待晾干呈粉末状后收集进行冷冻干燥，即为蜂毒冻干粉（crude bee venom lyophilized powder，CBVLP）样品。所有CBVLP样品在处理分析前储存在-20℃的冷冻器中。

1.2.2 蜂毒样品前处理方法

称取蜂毒样品10.0±0.1 g置于5 ml具塞离心管中，加入2 ml纯水，涡旋10 min混匀，从离心管中吸取部分蜂毒试样溶液用纯水稀释25倍，分别取1.0 ml母液和稀释25倍之后的样品溶液分别待分析。

1.2.3 HPLC-MS/MS条件

流动相为0.1%甲酸水和甲醇溶液；洗脱条件见表1；PFP色谱柱（100×2.7 mm，3.0 μm，安捷伦），柱温为30℃；流速为0.3 ml/min；进样量为2.0 μl。

表1液相梯度洗脱表

雾化器温度：350℃，雾化器流速：6 l/min，雾化器压力35 psi，毛细管电压：2000 V，鞘流气温度：350℃，鞘流气流速：9 l/min，锥孔电压：1000 V。目标化合物的母离子、子离子、传输电压和碰撞能量见表2。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理优化

生物胺的极性很大，因此高水溶性而低溶于脂肪。所以实验中对比了纯水、乙腈和甲醇等不同极性萃取剂对化合物的提取效率。比较发现，纯水显示出更高的提取效率和更少的基质效应。与其他两种有机溶剂相比，纯水也更环保，对实验人员造成的危害更小。因此，选择纯水作为最佳提取剂。

2.2 HPLC-MS/MS条件优化

由于组织胺、5-羟色胺、多巴胺、肾上腺素和去甲肾上腺素的结构特征（图1）十分相似，所以需要通过优化色谱条件以获得五种生物胺较高的响应值、最佳的分离、尖锐的峰形以及适当的保留时间。首先对比了两种常用的有机相乙腈和甲醇对生物胺的洗脱能力，在极性比较大的乙腈洗脱下，五种生物胺表现出更好的响应值和分离度。然而，乙腈作为有机相时组织胺的保留时间比较靠前，在体积内出峰，这种情况下将会由于内源性杂质的干扰而导致不准确的定量和鉴定。因此，选择甲醇作为有机流动相，以增加溶质保留并提高分辨率。

表2质谱参数

图1五种生物胺的化学结构式

五种生物胺的在电喷雾离子源正模式（Electronic Spray Ion，ESI）下的离子化效率，通过在水相流动相中加入甲酸或乙酸来提高。实验中对比了甲酸的比例从0.05%变化到0.5%时，五种生物胺的在仪器中的响应值高低和峰形的尖锐程度。最终，选择0.1%甲酸水和甲醇的组合作为最佳流动相。优化适当的梯度洗脱程序，不仅可以增加目标分析物的响应值，还可以缩短总体的运行时间。为了使五种生物胺的保留时间合适并且完全分离，甲醇的比例在0～98%改变，8分钟内五种生物胺出峰完毕。

表3方法标准曲线线性范围、相关系数、检测限和定量限

五种生物胺（5.0 μg/g）的单标工作溶液直接进入质谱进行过渡，以获得最强丰度的分子离子峰。每种化合物在全扫描模式（Scan）下选取一个母离子，并优化传传输电压（Fragmentor）将选取的母离子以最高的效率送入二级质谱中；在选择离子模式（selected ion mode，SIM）下选取两个子离子，并优化合适的碰撞能量（Collision energy，CE）得到最大强度的子离子色谱峰。同时，为了在MRM模式下获得最佳响应值，试验中对驻留时间、气体温度、干燥气体流速、雾化器压力、毛细管电压、鞘气温度、鞘气流量和喷嘴电压等参数进行了微调。在1000V～3500V范围内对毛细管电压进行优化，由于目标化合物的分子量很小，易发生源内碎裂解，所以选择2000V作为最佳毛细管电压。同时，实验中去甲肾上腺素由于在离子源的高温环境下容易失去一个H2O，所以其母离子选择 m/z 152.1，而非 m/ z170.1。基于HPLC-MS/MS分析的五种生物胺的MRM图谱见图2。

图2 5种生物胺的MRM色谱图（10μg/kg）

3 方法验证

为了评估开发方法的性能，研究从选择性、线性、检测限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quan－titation，LOQ）、回收率和精密度方面对方法进行了评价验证。

表4方法的回收率和日内、日间RSD

由于缺乏空白样品，质谱检测器中色谱峰很可能受到来自基质的其他内源性组分的干扰。测定峰纯度的一种简单方法是用二极管阵列检测器（diode array detector，DAD）[15]记录的光谱进行比较，通过DAD检测器在190～400 nm波长范围上覆盖蜂毒液样品中的组织胺、多巴胺、5-羟色胺、肾上腺素和去甲肾上腺素的每个峰的光谱，得以确认该方法的选择性。

实验中以加标样品和对照样品之间的分析物峰面积的差值为纵坐标，添加浓度为横坐标，绘制标准校正曲线y=kx+b，其中y指峰面积（y=yn-y0；yn是添加样品中目标化合物的峰面积，y0是对照样品中对应化合物的峰面积），x为添加样品中的添加量。为了提高较低浓度范围的精确度，将加权因子1/x应用于所有校准曲线，每个校准曲线包含6个浓度。在浓度范围0.5～1000 ng/ml内线性良好，相关系数R2＞0.998。

通过标准曲线获得的斜率（k）和y截距的标准偏差（S）计算所有分析物的LOD和LOQ，并以此评价方法灵敏度（LOD=3S/k；LOQ=10S/k）[12]。基于该方程，5种生物胺的LODs和LOQs值分别确定为：组织胺0.09μg/kg和0.31μg/kg；多巴胺0.17μg/kg和0.59μg/ kg；5-羟色胺0.10μg/kg和0.30μg/kg，肾上腺素0.17μg/ kg和0.56μg/kg，去甲肾上腺素为0.14μg/kg和0.45μg/ kg。

回收率在三个添加浓度（多巴胺、5-羟色胺、肾上腺素和去甲肾上腺素：0.2 μg/kg，2.0 μg/kg和20.0 μg/ kg；组织胺2.0 μg/kg，20.0μg/kg和200.0μg/kg）下获得。分别测定质控样品（C），加入三种浓度标准溶液的质控样品（B）和响应浓度的标准溶液（A）的目标化合物浓度，通过公式[(B-C）/A]×100计算回收率，五种化合物在蜂毒样品中的回收率高于80.95%，方法精密度由回收率的日内和日间相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）来评价，日内RSD范围为0.17～7.51%之间，5批次的日间RSD小于10.17%，符合要求，说明该方法准确可靠，适用于蜂毒中五种生物胺的定性定量分析。

4 结论

本研究第一次采用高效液相色谱串联质谱方法对蜂毒中的组织胺、多巴胺、5-羟色胺、肾上腺素和去甲肾上腺素进行了定性定量分析，样品制备程序简单环保，分析方法灵敏度高，重现性好，准确可靠，对于今后采用生物胺含量的差异对不同亚种蜂毒进行鉴别提供技术支撑。

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Determination of five ammonia amines in bee venom by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

Zhang Wenwen1，2，Jin Yue1，2，Zhou Jinhui1，2
（1 Institute of Apicutural Research,Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100093；2 Bee Product Quality Supervision and Testing Center Ministry of Agriculture，Beijing 100093）

A high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for the determination of histamine,dopamine,serotonin,epinephrine and norepinephrine in bee venom was developed.Bee venom samples were dissolved in pure water,centrifuged to take the supernatant,and analyzed by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry.The results showed that the five kinds of biogenic amines in the venom samples were linear in the range of 0.5～1000 ng/kg,R2＞0.998,the limitsof detection and the limits of quantification were 0.09～0.17 ng/kg and 0.30～0.59 ng/kg,the average recoveries range in the linear range is 80.9～111.4%,intraday RSD＜7.51%,interday RSD＜10.17%.The method has good precision and reproducibility,and is simple and rapid,green,suitable for the determination of biogenic amines in bee venom.

bee venom,biogenic amines,high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

张文文（1991-），女，硕士，蜂产品质量安全与分析，E-mail：bijihaierla@163.com

金玥（1985-），女，博士，蜂产品质量安全与分析，E-mail：yue_yue_jin@126.com；周金慧（1977-），男，博士，蜂产品质量安全与分析，E-mail：zhoujinhui@caas.cn