郑寿斌 和静芳 苏松坤 李志国

（福建农林大学蜂学学院，福州350002）

东方蜜蜂微孢子虫对中华蜜蜂的感染性和寿命的影响

郑寿斌 和静芳 苏松坤 李志国

（福建农林大学蜂学学院，福州350002）

为了探讨东方蜜蜂微孢子虫对中华蜜蜂工蜂的感染性和寿命的影响，用不同浓度梯度东方蜜蜂微孢子虫溶液感染刚出房的中蜂，并置于恒温箱内（30℃、RH：70～80%）培养。结果发现，接种14天后，与对照组相比，随着感染浓度的升高，感染浓度较高组的孢子感染量和感染率显著高于感染浓度较低组（P）；而根据每天记录的蜜蜂死亡情况分析，与对照组相比，感染浓度越高，中蜂的死亡率出现显著性差异的时间更早，这说明东方蜜蜂微孢子虫对中蜂寿命有影响。

东方蜜蜂微孢子虫；中蜂；感染；寿命

蜜蜂微孢子虫病是由微孢子虫引起的蜜蜂慢性传染性病害，现在已经遍布全球[1]。Zander在1909年首次在患病蜜蜂中肠上皮细胞中发现卵圆形小体，并确定该小体是寄生西方蜜蜂（Apis millefera）的微孢子虫孢子，并将这种寄生虫命名为蜜蜂微孢子虫（Nosema apis）[2]。东方蜜蜂微孢子虫则是寄生于东方蜜蜂（Apis cerana）体内的寄生虫[3]，1996年，瑞典乌普萨拉的瑞典农业大学Dr.Ingemar Fries发现其与西方蜜蜂的蜜蜂微孢子虫孢子在形态大小、极丝圈数以及16S SSUr－RNA基因序列不同，将其命名为东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）[4]。东方蜜蜂微孢子虫是慢性的消化系统寄生虫，其可以影响意蜂个体的生理、行为、健康和寿命，而且可能改变蜂群中工蜂的劳动分工、组织行为和数量[5]。被东方蜜蜂微孢子虫感染的意蜂，对蔗糖表现得更为敏感，并且更不易与其他蜜蜂交哺饲喂食物[6]。近年来，东方蜜蜂微孢子虫有逐渐取代西方蜜蜂微孢子虫并成为感染西方蜜蜂的主要微孢子虫种类的趋势[7]，它被认为是引起蜂群崩溃综合症（Colony Collapse Disorder，简称CCD）的一个主要原因之一[8]。东方蜜蜂微孢子虫对新寄主西方蜜蜂的影响已得到广泛的研究并已引起人们足够的重视[9]，但东方蜜蜂微孢子虫对原宿主中蜂影响的研究却相对较少。

本实验以意蜂来源的东方蜜蜂微孢子虫配成不同溶度梯度的孢子溶液，将其人工饲喂给刚出房的中蜂工蜂，并在实验期间，对不同溶度梯度东方蜜蜂微孢子虫对中蜂的感染量、感染率和寿命的影响进行研究。

1 材料与方法

1.1 仪器

光学显微镜（OLYMPUS）；微量进量器（上海医用激光仪器厂）；血球计数板；低速大容量离心机DL-SB型（上海安亭科学仪器厂）；KQ5200型超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；人工智能气候培养箱2RX-258D型（杭州钱江仪器设备有限公司）；超低温冰箱（海尔集团公司）；气泵高速冷冻离心机（Thermo Fisher Scientific中国有限公司）；MINI-8纯水机（中国科尔顿公司）；电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）

1.2 蜜蜂

意蜂和中蜂蜂群均来自福建农林大学蜂学学院实验蜂场。

1.3 方法

1.3.1 不同浓度梯度东方蜜蜂微孢子虫对中蜂感染性的影响

1.3.1.1 东方蜜蜂微孢子虫的提取：从意蜂蜂群巢门口抓取采集工蜂，拉取工蜂中肠并放入盛有1 ml无菌蒸馏水的离心管中，用研磨棒研碎，震荡均匀，离心机3000 r/min离心5分钟后，再用移液器去除上清液，加入1 ml无菌蒸馏水并震荡，使孢子悬浮在水中。而后3000 r/min离心5分钟，再用移液器移除上清液加1 ml无菌蒸馏水，使孢子悬浮在水中。接着配置25%、50%、75%和100%的Percoll溶液，利用Percoll梯度离心技术，将孢子悬浮液加入梯度浓度的Percoll溶液上，4℃，5000 r/min离心20分钟。用移液器移除上清液，加入1 ml无菌蒸馏水并震荡，使孢子悬浮在水中。最后离心机10000 r/min离心5分钟，再用移液器移除上清液，用1 ml无菌水悬浮孢子虫，即可得到纯化后的东方蜜蜂微孢子虫溶液。经血球计数板计数后，即可得到纯化孢子虫的浓度。

1.3.1.2 东方蜜蜂微孢子虫的感染：用50%的蔗糖溶液将纯化后的孢子虫溶液配制成五个浓度梯度：1/2×103个/μl、3/2×103个/μl、1/2×104个/μl、3/2×104个/μl、1/2×105个/μl，用不同浓度梯度孢子溶液以及50%的蔗糖溶液分别饲喂已准备好的中蜂，每只蜜蜂饲喂2 μl。将处理后中蜂放在恒温箱内培养（30℃、RH:70～80%）。到第14天，将中蜂中肠拖出，研磨，离心配置成100 μl孢子液，再稀释100倍，用血球计数板计数每只中蜂感染孢子数。统计分析各感染梯度的中蜂孢子感染量和感染率。

1.3.2 不同浓度梯度东方蜜蜂微孢子虫感染对中蜂寿命的影响

采用上述方法提取东方蜜蜂微孢子虫并感染中蜂，将中蜂放在恒温箱内培养（30℃、RH:70～80%）。每天记录中蜂的死亡数量，直至所有中蜂死亡，统计分析各感染梯度中蜂的死亡率。

1.3.3 统计分析

各感染梯度的中蜂感染孢子量、感染率和死亡率均用SPSS软件的LSD法进行统计分析。

2 结果与分析

不同感染梯度孢子感染中蜂14天后，得到中蜂感染孢子量如下图1：对照组中蜂不感染，3×104个/μl、105个/μl感染组中蜂之间孢子感染量差异不显著（P）；3×104个/μl感染组与103个/μl、3×103个/μl、104个/μl感染组之间孢子感染量差异极显著（P）；105个/μl感染组与103个/μl感染组之间孢子感染量差异极显著（P），与3×103个/μl、104个/μl感染组之间孢子感染量差异显著（P）。结果表明，在一定的东方蜜蜂微孢子虫感染浓度梯度范围内，随着孢子感染浓度的升高，微孢子虫对中蜂的感染量也升高，当感染浓度达到3×104个/μl时，东方蜜蜂微孢子虫对中蜂的孢子感染量不再升高。

图2 不同梯度东方蜜蜂微孢子虫处理后中蜂的感染率（14d）

不同感染梯度孢子感染中蜂14天后，被感染中蜂感染率如图2：对照组感染率为0，据统计学分析，103个/μl感染组，与104个/μl感染组差异显著（P），与3×104个/μl和105个/μl感染组差异极显著（P）；3×103个/μl感染组与3×104个/μl感染组差异显著（P），与105个/μl感染组差异极显著（P）；104个/μl感染组与105个/μl感染组差异显著（P）。结果表明，随着孢子虫感染溶液浓度的增大，孢子虫对于中蜂的感染率随之增大，当孢子感染梯度为105个/μl时感染率达到100%。

图3不同梯度东方蜜蜂微孢子虫处理后中蜂的死亡率（14d）

不同孢子感染梯度的中蜂死亡率如图3，据统计学分析，当培养到第9天时105个/μl感染组与对照组的死亡率差异显著（P）；到第11天时，3×104个/μl感染组与对照组死亡率差异显著（P），105个/μl感染组与对照组的死亡率差异极显著（P）；第36天时，104个/μl感染组与对照组死亡率差异显著（P）；第37天时，3×103个/μl感染组与对照组死亡率差异显著（P）；而感染浓度最小的103个/μl感染组与对照组死亡率差异一直不显著（P）。结果表明，随着东方蜜蜂微孢子虫感染浓度的增大，孢子虫对于中蜂的寿命影响越大。

3 讨论

试验结果显示，在一定的东方蜜蜂微孢子虫感染浓度范围内，东方蜜蜂微孢子虫对被感染中蜂工蜂的孢子感染量和感染率，是随感染浓度的增加而增加的，并且，当东方蜜蜂微孢子虫的感染浓度达到3×104个/ μl时孢子感染量达到最大，而当感染浓度达到105个/ μl时感染率达到最大值100%。这一结果对于了解东方蜜蜂微孢子虫对中蜂的感染性有重要的意义，并且，为进一步研究东方蜜蜂微孢子虫与中蜂的关系提供了数据基础。而东方蜜蜂微孢子虫的感染浓度同样对中蜂的寿命产生影响，浓度最高的3×104个/μl、105个/μl两感染组的死亡率最早在第11天和第9天就显著高于对照组，而感染浓度相对低的3×103个/μl、104个/μl组的死亡率分别到第36天和第37天才显著高于对照组，而103个/μl死亡率与对照组则不出现显著性差异。这表明，东方蜜蜂微孢子虫对中蜂工蜂的感染浓度的越大，对中蜂工蜂的寿命影响越大。

由于生态系统内各生物间存在紧密的联系，所以对于蜜蜂这种慢性寄生虫的研究需要更加全面。除了东方蜜蜂微孢子虫与它的新宿主西方蜜蜂的关系研究外，东方蜜蜂微孢子虫对其他蜂种尤其是中蜂的作用机理更需要去深刻的研究。只有对于东方蜜蜂微孢子虫更为全面的了解，才能采取更加高效的措施来抑制它的感染，降低危害，并提高养蜂的经济效益。

[1]Fries I.Nosema apis-a parasite in the honey bee colony[J].Bee World，1993,74(1):5-19.

[2]Zander E.Tierische parasiten als krankenheitserreger bei der biene[J].Münchener Bienenzeitung，1909,31:196-204.

[3]Martin S J.The role of Varroa and viral pathogens in the collapse of honeybee colonies:a modelling approach[J].Journal of Applied Ecology，2001,38(5):1082-1093.

[4]Fries I,Feng F,Da Silva A,et al.Nosema ceranae n.sp.(Microspora,Nosematidae),morphological and molecuLar characterization of a microsporidian parasite of the Asian honey bee Apis cerana (Hymenoptera,Apidae)[J].European Journal of Protistology，1996,32(3):356-365.

[5]Holt H L,Aronstein K A,Grozinger C M.Chronic parasitization by Nosema microsporidia causes global expression changes in core nutritional,metabolic and behavioral pathways in honey bee workers (Apis mellifera)[J].BMC genomics，2013,14(1):799.

[6]Naug D,Gibbs A.Behavioral changes mediated by hunger in honeybees infected with Nosema ceranae[J].Apidologie，2009,40 (6):595-599.

[7]Klee J,Besana A M,Genersch E,et al.Widespread dispersal of the microsporidian Nosema ceranae,an emergent pathogen of the western honey bee,Apis mellifera[J].Journal of invertebrate pathology，2007,96(1):1-10.

[8]Oldroyd B P.What's killing American honey bees[J].PLoS biology，2007,5(6):168.

[9]Derede A,Courchamp F.Extinction thresholds in host-parasite dynamics[J].Annales Zoologici Fennici，2003,40(40):115-130.

The influence of Nosema ceranae to the life and infection of Apis cerana cerana

Zheng Shoubin，He Jingfang，Su Songkun，Li Zhiguo
（College of Bee Science,Fu jian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002）

To inquire into the infectivity of Nosema ceranae in colony and the influence of life of bees（Apis cerana cerana）infected by Nosema ceranae,We use the solution of different concentration Nosema ceranae to infect the newly emerge bees,which are grouply trained at constant temperature box（30℃,RH:70～80%）.The results found that 14 days after inoculation,compared with the control group,with the increase of concentration of infection,the amount of spore infection and the infection rate of higher concentration infection group is significantly higher than low concentration of infection group（P）.To analyze the number of the daily dead bees,Compared with the control group,the higher infection concentration group has the significantly mortality rate in earlier time.In a word,the Nosema ceranae definitely infect bees（Apis cerana cerana）and change their life.

Nosema ceranae;Apis cerana cerana;infection;life

福建省自然科学基金青年创新项目资助（NO.2016J05063）

郑寿斌（1989-），男，硕士研究生，研究方向为蜜蜂保护，E-mail：863686642@qq.com

李志国，博士，讲师，主要从事蜜蜂科学研究，E-mail:zhiguo.li@fafu.edu.cn