叶维雁++刘惠民++李贤忠++王倩++何静++夏赛

摘要：以葡萄柚无菌实生苗的上胚轴、下胚轴和叶片为外植体，研究其组织培养和植株再生技术。结果表明，葡萄柚上胚轴分化不定芽的能力最强；诱导不定芽的最佳培养基为WPM+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+AgNO3 2 mg/L+蔗糖40 g/L，培養40 d后不定芽分化率为78.33%，不定芽数为3.66个；最适生根培养基为l/2 WPM+NAA 1.5 mg/L+AC 0.1%+蔗糖40 g/L，生根率达73.33%，生根数为1.91条/株；生根苗移栽30 d后成活率达70%以上。

关键词：葡萄柚；离体培养；不定芽；植株再生

中图分类号： S666.304+.3文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）09-0034-04

葡萄柚（Citrus paradise Macf.）属芸香科柑橘属常绿植物，香港称为“西柚”，在广东新会一带又称“番柑”，是甜橙和柚的天然杂交种，结果时果实悬挂成串，簇生如葡萄，因此被称为葡萄柚[1]，为世界四大柑橘类群（宽皮柑橘类、甜橙类、柠檬来檬类、葡萄柚和柚类）之一[2]。葡萄柚果实风味独特、柔软多汁、酸甜可口，口感好，可用于制备新鲜果汁、罐头和沙拉[3]，含有丰富的维生素C、柚苷和橙柑，具有消除疲劳、清热退火、消食、减肥和护肤等特殊功效[4]，具有较高的经济价值和药用价值。

葡萄柚传统种子繁殖方式的遗传性状易产生较大变异，而嫁接方式成本较高，很难满足市场对良种苗木的大量需求。利用组织培养技术进行葡萄柚良种的快速繁殖可以克服常规方法费时的缺点，还可获得具有高度一致和优良表型的群体，而且创建高效、稳定的植株再生体系可以为葡萄柚的无病苗木繁育、诱变育种及遗传转化创造有利条件。迄今为止，许多柑橘品种已经在组织培养与再生体系的构建上取得了成功[5-12]，而关于葡萄柚再生体系建立的报道仍很少，本试验以葡萄柚种子萌发的无菌苗为试材，构建稳定的植株再生体系，并探讨几个相关的影响因素，以期为葡萄柚的快速繁殖、品种改良和遗传转化提供参考。

1材料与方法

1.1无菌实生苗的获取

2013年11月从云南省林科院西双版纳州普文葡萄柚试验园挑选生长结果良好的帕利斯（Perlist）品种植株，取其成熟鲜果的饱满种子，装入大烧杯，烧杯口用纱布封住，流水冲洗干净表面黏液。在超净工作台内用75%乙醇表面灭菌 15 s，再用0.1% HgCl2浸泡20 min，无菌水冲洗8次，在无菌滤纸上剥去内外种皮，接种于1/5 WPM固体培养基上。1 L 0.1% HgCl2中滴加1～2滴吐温-20，以提高HgCl2的杀菌效果[13]。21 d后，取无菌实生苗作为外植体供体。

1.2不定芽的诱导

1.2.1不同浓度的TDZ与NAA对不定芽诱导的影响

以WPM+蔗糖40 g/L为基本培养基，添加不同浓度的植物生长调节剂苯基噻二唑基脲（thidiazuron，TDZ）0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L和萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid，NAA）0.1 mg/L，共7个处理。取21 d苗龄的无菌实生苗，在上胚轴中部切取长约1.5 cm的小段，水平接种在培养基上，每处理接种20个上胚轴小段，重复3次，40 d后统计愈伤诱导率、不定芽分化率、不定芽数。

1.2.2不同浓度的AgNO3对不定芽诱导的影响

以 WPM+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖40 g/L为基本培养基，添加不同浓度（0、0.5、1.0、2.0、5.0、10 mg/L）的 AgNO3，共6个处理。取21 d苗龄的无菌实生苗，在上胚轴中部切取长约1.5 cm的小段，水平接种在培养基上，每处理接种20个上胚轴小段，重复3次，40 d后统计愈伤诱导率、不定芽分化率、不定芽数。

1.2.3不同浓度的蔗糖对不定芽诱导的影响

以WPM+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+AgNO3 2.0 mg/L为基本培养基，添加不同浓度（20、30、40、50、60 g/L）的蔗糖，共5个处理。取21 d苗龄的无菌实生苗，在上胚轴中部切取长约 1.5 cm 的小段，水平接种在培养基上，每处理接种20个上胚轴小段，重复3次，40 d后统计愈伤诱导率、不定芽分化率、不定芽数。

1.2.4不同外植体对不定芽诱导的影响

从21 d苗龄的无菌实生苗中分别选取上胚轴、下胚轴、叶片作为外植体，水平接种于WPM+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+AgNO3 2.0 mg/L+蔗糖40 g/L培养基上，共3个处理，每处理接种20个外植体，重复3次，40 d后统计愈伤诱导率、不定芽分化率、不定芽数。

1.3生根培养

当不定芽长至约2 cm时，切下长势较好且大小相同的单芽接种于生根培养基中。生根培养基以1/2 WPM+蔗糖 40 g/L+活性炭（activated carbon，AC）0.1%为基本培养基，附加不同浓度（0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）的NAA，每处理接种20个单芽，重复3次。生根培养40 d后统计生根率、生根数，观察根的生长情况，筛选出适合不定芽生根的培养基。

1.4炼苗移栽

挑选生长健壮的生根苗置于室内自然光下炼苗7 d，其间逐渐松开瓶盖，使生根苗逐渐适应外界环境。挑选长势较好、株高约3 cm、根长约8 cm的生根苗64株，洗净根部的培养基后，移栽到由草泥炭、珍珠岩、蛭石、红土（体积比为 2 ∶1 ∶1 ∶1）组成的混合基质中，用多菌灵液浇透基质，注意水分、光照、温度的管理，30 d后统计成活率。

1.5培养条件

WPM培养基均添加琼脂5 g/L；1/2 WPM培养基里大量元素减半，其他元素含量不变，含琼脂5 g/L；1/5 WPM培养基里各元素含量均减为WPM培养基的1/5，含琼脂3 g/L。pH值调至5.7±0.1，121 ℃高压灭菌18 min后冷却备用，培养温度为（26±1）℃，光照度1 500 lx，光照时间14 h/d。

1.6数据处理

试验数据使用SPSS 21.0进行单因素方差多重比较分析。观测变量计算公式如下：

愈伤诱导率=产生愈伤组织的外植体数/接种的外植体数×100%；

不定芽分化率=长出不定芽的外植体数/接种的外植体数×100%；

不定芽数=长出的不定芽总数/长出不定芽的外植体数；

生根率=生根的不定芽数/接种的不定芽数×100%；

生根数=长出的总根数/生根的不定芽数；

移栽成活率=移栽成活苗数/移栽苗数×100%。

2结果与分析

2.1不同浓度的TDZ与NAA对不定芽诱导的影响

上胚轴培养7 d后两端切口处开始膨大，12 d左右在两端切口处有少量淡绿色愈伤组织形成，但随后愈伤组织并无明显增加。18 d左右在两端切口处开始出现绿色芽点，23 d左右在綠色芽点处开始出芽，并于30 d左右达到高峰（图1-A），40 d后不定芽的长度达1.0～1.5 cm（图1-B），最长的约2 cm。TDZ与NAA不同的浓度组合对不定芽分化的影响是不同的，其结果见表1。在NAA浓度为0.1 mg/L的条件下，不同浓度的TDZ均可诱导上胚轴产生愈伤组织和不定芽，但愈伤诱导率、不定芽分化率及不定芽数都有所差异；而不含TDZ的培养基里上胚轴无愈伤组织和不定芽形成。TDZ浓度为1.5 mg/L时愈伤组织诱导率达到最高值，为 71.67%，显著高于其他处理；TDZ浓度为1.0 mg/L时不定芽分化率最高，为56.67%，极显著高于其他处理；TDZ浓度为1.0 mg/L时不定芽数最多，达到3.08个，极显著高于其他处理。当TDZ浓度由1.0 mg/L增加至2.0 mg/L，不定芽分化率降低，不定芽数减少。由此可见，虽然TDZ是一种强力的细胞分裂素，但对于葡萄柚上胚轴不定芽的分化，其浓度并不是越高越好，过高浓度的TDZ反而会抑制不定芽的分化。

2.2不同浓度的AgNO3对不定芽诱导的影响

如表2所示，当AgNO3浓度为0.5～5.0 mg/L时，上胚轴的愈伤诱导率、不定芽分化率、不定芽数均高于对照（不添加AgNO3的处理），其中AgNO3浓度为2.0 mg/L时愈伤诱导率、不定芽分化率、不定芽数均达到最高值，分别为 85.00%、7833%、3.66个；当AgNO3浓度由2.0 mg/L增加到 5.0 mg/L 时，愈伤诱导率、不定芽分化率、不定芽数均明显降低，当AgNO3浓度增加至10.0 mg/L时，愈伤诱导率、不定芽分化率、不定芽数都已低于对照，表明过高浓度的AgNO3对葡萄柚上胚轴愈伤组织、不定芽的诱导均具有抑制作用。

2.3不同浓度的蔗糖对不定芽诱导的影响

蔗糖浓度对上胚轴不定芽的分化有明显影响（表3）。当蔗糖浓度为40 g/L时，不定芽的诱导效果最好，不定芽分化率和不定芽数均达到最高值，分别为76.67%和3.69个，且不定芽生长粗壮；当蔗糖浓度为20 g/L时，不定芽分化率和不[CM（25]定芽数分别低至45.00%和1.89个，不定芽生长细弱，这可能是其后期生长中碳源和能源不足导致的；另一方面，高浓度（60 g/L）蔗糖抑制了不定芽的再生，不定芽分化率和不定芽数分别只有48.33%和2.11个，这可能是蔗糖浓度过高导致瓶内空气湿度变小或培养基渗透压升高，形成的一些不利因素造成的。

2.4不同外植体对不定芽诱导的影响

不同外植体对葡萄柚不定芽的诱导影响很大，结果如表4所示，上胚轴和下胚轴均能分化出不定芽，而叶片始终未能分化出不定芽，其中上胚轴分化不定芽的能力最强，不定芽分化率达76.67%，不定芽数达到3.65个，均极显著高于下胚轴和叶片。此外，上胚轴一般于接种23 d后开始分化形成不定芽，在28 d左右集中出芽，而下胚轴一般于接种25 d后才开始分化形成不定芽，在30 d左右集中出芽；由此可见，上胚轴的出芽时间要比下胚轴提前2 d左右，这在一定程度上也反映了上胚轴分化不定芽的能力要强于下胚轴，更适合作为葡萄柚不定芽诱导的外植体。

2.5生根培养

不同浓度的NAA对不定芽生根的诱导效果如表5所示，接种40 d后，除对照外均能诱导出一定数量的不定根（图1-C），且都较粗壮，部分生根苗除有主根外，还有1～3条侧根，长3～6 cm。说明添加一定量的生长素对葡萄柚不定芽的生根是必须的，其中培养基1/2 WPM+NAA 1.5 mg/L+AC 0.1%+蔗糖40 g/L的生根效果最好，生根率达73.33%，生根数为1.91条/株，均显著高于其他培养基。当NAA浓度由1.5 mg/L增加至2.0 mg/L时，生根率和生根数分别降低至58.33%和1.31条/株，说明高浓度的NAA对葡萄柚不定芽的生根产生抑制作用。

2.6炼苗移栽

生根苗经炼苗后移栽至基质（草泥炭 ∶珍珠岩 ∶蛭石 ∶红土=2 ∶1 ∶1 ∶1，体积比）中，21 d后幼苗开始长出新叶（图1-D），30 d后成活率达70%以上。

3讨论与结论

在植物的离体培养中，在培养基中添加一定量的植物生长调节剂可以调节外植体的激素水平，从而促进不定芽的分化和再生。TDZ是一种苯基脲衍生物，细胞分裂素活性高于6-BA和KT，作为一种有效的形态发生调节剂被广泛用于植物组织培养[14]，范围遍及草本植物[15-19]和木本植物[20-23]。在含有TDZ（浓度0.1～2.0 mg/L）的培养基中均能诱导葡萄柚上胚轴不定芽的分化和形成，其中以1.0 mg/L TDZ诱导效果最好。高浓度的TDZ抑制葡萄柚上胚轴不定芽的分化，当TDZ浓度大于1.0 mg/L时，不定芽分化率开始呈现下降的趋势，不定芽数也开始减少。细胞分裂素和生长素按适当的比例组合在一起有很强的协同作用，一般情况下能更有效地促进不定芽的的分化与生长，TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 的组合对葡萄柚上胚轴不定芽的诱导效果最好，不定芽分化率达56.67%，不定芽数达3.08个，这可能是由于TDZ 1.0 mg/L 和NAA 0.1 mg/L的浓度配比刚好达到了上胚轴直接分化不定芽的生理要求，更好地促进了DNA、RNA、蛋白质的合成，细胞的生长、分裂更加旺盛，促使不定芽的再生。

AgNO3是一种较好的乙烯抑制剂，其提高不定芽再生能力已在多种植物上得到证实[24-26]。试验中AgNO3可明显提高葡萄柚上胚轴的不定芽分化率，且不同浓度的AgNO3对不定芽的分化有不同的影响，培养基WPM+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖40 g/L中添加2.0 mg/L AgNO3最适合葡萄柚上胚轴不定芽的分化，不定芽分化率达78.33%，不定芽数达3.66个；在相同的激素配比下，不定芽分化率随着AgNO3浓度（大于2.0 mg/L时）的升高而下降，此时AgNO3表现出一定的副作用；AgNO3浓度由2.0 mg/L增加至 5.0 mg/L 时不定芽分化率开始降低，不定芽数开始减少，当 AgNO3 浓度达到10 mg/L时已表现出抑制作用，不定芽分化率、不定芽数均低于不添加AgNO3的处理。这可能是由于过多的Ag+破坏了离子平衡，以及对植物体的毒害作用所致。

植物组织培养中，糖类为培养物生长发育提供碳源和能源，并有调节培养基渗透压的作用，其中最常用的糖类是蔗糖[27]；蔗糖浓度过低，碳源和能量供应不足，导致不定芽生长不良；蔗糖浓度过高，导致不定芽失水而生长不良。葡萄柚不定芽诱导的最适蔗糖浓度为40 g/L，此时不定芽分化率和不定芽数分别为76.67%和3.69个。

植物组织培养中为获得较高的不定芽分化率，除了筛选合适的激素组合及浓度配比外，还要选择合适的外植体类型。以葡萄柚的上胚轴、下胚轴、叶片作为外植体进行不定芽的诱导，难易程度不同，由易到难表现为上胚轴>下胚轴>叶片，其中上胚轴的不定芽分化率最高，达76.67%，与蕉柑[28]、沙田柚[29]不定芽诱导的表现一致，而叶片始终未能形成不定芽，这可能是由于上胚轴、下胚轴、叶片所含内源激素水平不同进而对外源激素种类、浓度的要求有差别而导致的[30]。植物离体培养中不定芽的分化通常有直接发生型和间接发生型2种途径，本研究中不定芽的分化属于直接发生型，各试验组合均能诱导不定芽直接形成，虽然在切口表面有1圈白色松软的愈伤组织形成，但不定芽基本都是从材料切口表面直接形成，未经过愈伤组织阶段。此外，不定芽的分化位点有2种，一种是在机械损伤处如切口，有观点认为机械损伤能刺激细胞分裂从而促进组织分化，最后引起不定芽的分化和形成；另一种是在没有机械损伤处也能产生不定芽，即不定芽的出现不以出现机械损伤为前提。对于葡萄柚，无论是上胚轴还是下胚轴，不定芽均在有机械损伤的两端切面产生，没有机械损伤的部位没有不定芽的产生，证明葡萄柚无菌实生苗上、下胚轴不定芽的发生是以发生机械损伤为前提条件的。

离体培养条件下不定芽的生根通常须有生长素的诱导，NAA、IBA是诱导生根效果较好且十分常用的2种生长素。葡萄柚不定芽生根试验采用NAA进行不定根的诱导，以培养基l/2 WPM+NAA 1.5 mg/L+AC 0.1%+蔗糖40 g/L的生根率最高，生根率达73.33%，生根数为1.91条/株，根系粗壮；生根试验中生根苗主根上普遍只有少量侧根（0～3条）长出，不利于移栽后生根苗的存活，这可能与葡萄柚的基因型有关。关于如何诱导葡萄柚的离体芽苗长出有大量侧根的根系，还须要作进一步研究。

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