杨宏芳 朱宏阳 李泳宁 王金海 林伟铃

摘要 γ-氨基丁酸（GABA）是一种广泛存在于动植物体内的非蛋白质天然氨基酸，具有重要的生理活性，在医疗、食品加工等领域应用广泛。论述了微生物发酵法生产GABA及乳酸菌的诱变选育和发酵条件优化等方面的研究进展。

关键词 γ-氨基丁酸；乳酸杆菌；研究进展

Research Progress on the Preparation of γ-aminobutyric Acid by Microbial Fermentation

YANG Hong-fang，ZHU Hong-yang*，LI Yong-ning et al （Fujian Health College，Fuzhou，Fujian 350101 ）

Abstract γ-aminobutyric acid is one of non-protein natural amino acids which widely exists in animals and plants.GABA has wide application in the medical and food industries due to its important physiological activity.This paper discusses the GABA production by microbial fermentation and the research progress of mutation breeding of lactic acid bacteria and its optimization of culture medium.

Key words γ-aminobutyric acid；Lactic acid bacteria；Research progress

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA，又称氨酪酸），分子式为C4H9NO2，分子量103.12，是广泛存在于动物、植物和微生物中的一种非蛋白质天然氨基酸[1]。GABA是植物细胞内自由氨基酸的重要组分，当细胞受到损伤、冷热刺激、组织缺氧时，植物体内GABA含量快速增加。此外，GABA还是脊椎动物中枢神经系统中的一种重要的抑制性神经递质。研究表明，GABA对哺乳动物具有增进食欲、促进消化、降血压、改善睡眠、镇静、抗心率失常、调节激素分泌、促进生殖等功能[2]。其在医疗、食品加工等领域具有广泛的应用前景，其市场需求量日益增加，由于GABA天然含量很低，单纯依靠天然物质提取远远不能满足市场的需求[3]，因此有必要研究人工制备GABA的方法。

1 GABA的制备方法

目前GABA的制备方法主要有化学合成法和生物合成法，生物合成法又分为植物富集法和微生物发酵法。

1.1 化学合成法

化学合成法多以γ-氯丁氰和邻苯二甲酰亚氨钾或其他化合物于高温下反应，并通过结晶分离提取获得GABA[4]。化学合成法虽已应用于生产，但其存在原料价格高昂、毒性大，反应条件剧烈、设备成本高，易产生副产物、分离效果差，安全性能差易造成环境污染等问题。新报道的合成方法虽有许多改善，但流程步骤多，要实现工业化生产还需进一步改进工艺流程。

1.2 生物合成法

1.2.1 植物富集法。植物富集法有2条途径：一是转化途径（主要途径），谷氨酸经谷氨酸脱羧酶催化转化合成GABA，通过外界条件刺激植物组织产生应激代谢而生成；二是多胺降解，植物体内的多胺在多胺氧化酶的作用下，氧化脱氨形成H2O2、氨和4-氨基丁醛，4-氨基丁醛脱水后生成1-吡咯啉，经吡咯啉脱氢酶作用下生成GABA[5]。与化学合成法相比，植物富集法操作简单易行，但由于其产率低、分离提取困难而导致其成本居高不下，在工业化生产中存在较大的局限性。

1.2.2 微生物发酵法。

微生物发酵法主要是利用微生物细胞中谷氨酸脱羧酶将L-谷氨酸转化为GABA，已被用于GABA生产的菌株有大肠杆菌（Escherichia coli） [6]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） [7]、曲霉（Aspergillus） [8]、酵母菌（Saccharomyces） [9]、乳酸菌（Lactobacillus）[10]等。这类微生物具有生长速度快、周期短、条件温和、代谢简单及分布广泛的优点，以微生物发酵法生产GABA不受空间、环境和资源的限制，有利于规模化、工业化生产，因此此法制备GABA已成为近年来生产GABA的研究热点。

2 微生物发酵法生产GABA

目前，用于微生物发酵法生产GABA菌种有酵母菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、曲霉菌、乳酸菌等。

2.1 酵母菌发酵法

酵母菌是单细胞真核生物，被广泛应用于酿酒行业，是非常重要的微生物资源。近来的一些研究发现酵母菌具有谷氨酸脱羧酶活性，因此酵母菌可被应用于生产GABA。如Takahashi等[11]选育获得Saccharomyces cerevisiae K701的突变株GAB7-2，GABA在发酵液中浓度为0.043 g/L。赵国群等[12]从梨果实筛选获得S.cerevisiae KS45菌株于30 ℃下发酵10 d可获得2.427 g/L的GABA。肖婧等[13]从新疆特色食品中筛选获得一株有孢汉逊酵母菌株XYN019，对其进行紫外诱变选育，33.95 ℃下发酵49.17 h，GABA产量可达4.926 g/L。

2.2 大肠杆菌发酵法

生物法制備GABA的早期研究中，以大肠杆菌发酵法为主。如赵景联[14]采用海藻酸钙包埋法固定E.coli，采用柱式反应转化的方法转化1%的谷氨酸溶液产GABA，其转化率可达85%；陈蔚青等[15]以海藻酸钠与明胶协同包埋E.coli细胞，经优化反应条件后，谷氨酸转化率可达98.7%；杨帆[16]采用先培养E.coli AS1.505细胞，然后再投入谷氨酸的方式获得60 g/L的GABA，转化率为100%；Plokhov等[6]利用有高谷氨酸脱羧酶（GAD）活性的重组E.coli GADK10催化转化谷氨酸合成GABA，产量高达280～300 g/L。虽然利用E.coli可实现高效制备GABA，但由于E.coli在食品工业中存在着较大的安全隐患，因此在食品工业中很少采用E.coli制备GABA，一般仅用于化工原料生产。

2.3 枯草芽孢杆菌发酵法

枯草芽孢杆菌目前在生物法制备GABA中的研究相对较少，但其作为一种生物安全性较高的表达系统，在构建重组全细胞催化生产GABA的研究日渐增多。如莫征杰等[17]利用从植物乳杆菌中得到的GAD （Glutamate decarboxylase）基因，构建质粒pMA5/lapgad，在B.subtilis W B600系统中进行异源重组表达，胞内酶活达0.35 U/mL，为全细胞合成GABA提供指导意义；丁伟等[18]构建了一株产GAD的重组枯草芽孢杆菌，并对其发酵条件进行了优化，在优化条件下，GAD酶活达0.413 U/mL；由于枯草芽孢杆菌中无磷酸吡哆醛的再生途径而使得转化效率低下。张六六等[19]将GAD基因（gadA）和磷酸吡哆醛再生基因（pdxH）在质粒pHT01上串联，构建B.subtilis 168/pHT01-gadA-pdxH，通过增加辅酶磷酸吡哆醛的量而提高菌株对底物谷氨酸的转化率，在最优条件下，该菌株催化24 h，GABA可达327.00 g/L。

2.4 曲霉菌发酵法

曲霉是一种腐生真菌，可耐酸性，曲霉含有丰富的酶系统，可进行多种生理生化反应，GABA是其众多代谢产物之一。用于生产GABA的曲霉菌主要为红曲霉。如胡珊等[20]從传统发酵食品中筛选获得20株红曲霉菌株，其中MXL-8是高产GABA的，经优化培养基后摇瓶发酵6 d获得约22.373 g/L的GABA；秦江辉等[21]对Monascu 3.4450进行60Co诱变选育，获得8株GABA产量较高的菌株，其中25号菌株GABA产量达5.255 mg/g；张庆庆等[8]利用M.pilosus ZL307进行固态发酵豆渣获得417.00 mg/kg的GABA。然而，目前曲霉菌生产GABA的效率很低，工业化难度还很大。

2.5 乳酸菌发酵法

乳酸菌作为一种食品安全级细菌被广泛应用于食品和医药工业，目前国内外已有多株GABA高产乳酸菌株的报道。如由Yokoyama S等[22]从酒糟中筛选获得的L.brevis IFO12005，发酵2 d，GABA可达6.300 g/L；缪存影等[23]从酸菜中筛选获得一株高产GABA乳酸菌，静置发酵可获13.450 g/L的GABA；由Kim等[24]分离获得的L.brevis GABA100培养12 d后，GABA含量为26.900 g/L；周青等[25]从泡菜中筛选获得的L.plantarum可产1.260 g/L的GABA。

3 产GABA乳酸菌株诱变选育及发酵条件优化

目前，生产GABA的研究主要聚焦于乳酸菌，然而国内外学者在研究中分离获得的不同乳酸菌其产GABA的能力各不相同。为了获得GABA的高产菌株，国内外学者对乳酸菌株的诱变选育及发酵条件优化等进行了深入的研究。

3.1 乳酸菌株诱变选育

从自然界直接分离获得的野生型菌株积累产物的能力普遍较低，因此无法满足工业生产的要求。通过诱变育种的方法提升菌株的生产能力，是发酵工业中实现生产能力提升的最有效途径。在微生物诱变育种中，常用的诱变育种方法有物理诱变、化学诱变及生物诱变。

3.1.1 物理诱变。物理诱变中常用的诱变剂有紫外线（UV）、γ-射线、X射线及N+离子束注入等。刘婷婷等[26]利用紫外诱变处理L.plantarum LP-GB 01后采用GABA梯度平板选育获得LP-GB 01-21，GABA产量可达51.900 g/L，比出发株提高了55.39%；夏江等[27]将L.brevis hjxj-01先用紫外诱变处理后再用60Co进行诱变处理，获得hjxj-08119，GABA产量可达17.000 g/L，比出发株提高了142.90%；张颖等[28]利用30 keV的N+离子束注入处理L.brevis TCCC13007，筛选获得S2菌株，优化培养基中GABA产量达35.000 g/L，提升了31.00%。

3.1.2 化学诱变。化学诱变剂种类繁多，在微生物育种中常用的有烷化剂、碱基类似物、脱氨基、金属盐等，其中最常用的为烷化剂，如亚硝基胍（NTG）、甲基磺酸乙酯（EMS）、硫酸二乙酯（DES）等。化学诱变剂诱变效果不一，不同菌株之间对诱变剂的敏感度不同，在育种实践中常采用复合诱变方式来提升菌株突变率。如李秀凉等[29]对乳酸片球菌采用UV和NTG复合诱变筛选获得突变株UN-27，GABA平均产量为5.020 g/L，与出发菌株相比提升472.00%；葛菁萍等[30]将短乳杆菌HDBR-02经UV和NTG复合诱变后获得突变株F11，产量达8.900 g/L，与出发菌株相比提高了300.00%。

从上述研究中可以看出，诱变育种虽然可以提升菌株产GABA的能力，但诱变育种中有利变异较少，诱变方向和性质较难控制，且易产生回复突变，筛选工作量大，想要大幅提高GABA产量，还需对筛选获得的突变株的发酵条件进行优化才能进一步提高GABA的产率。

3.2 发酵条件优化

发酵条件的优化是为了找出适合不同菌种的最适发酵条件，得出最优生产GABA的方案，从而可以降低生产成本。发酵条件优化一般包括营养条件如碳源、氮源和无机盐组成的优化，环境因素如发酵温度、pH、通风量等因素的优化。

2010年，范杰等[31]以分离自泡菜的短乳杆菌为研究对象，对其发酵培养基进行优化，优化后发酵液中GABA含量达14.150 g/L。王兴洁等[32]从四川泡菜水中分离获得1株植物乳杆菌W1-9，对其以MRS为基础的GABA发酵培养基进行了优化，以黄瓜汁为发酵培养基，初始pH 5.5，底物谷氨酸钠添加量12.00 g/L，菌液接种量1.20%，该条件下GABA产量达7.620 g/L，比初始2.180 g/L提高249

.00%。尹然等[33]以植物乳杆菌Lb-17为出发菌株，利用单因素试验和Box-Behnken响应面试验对发酵培养基进行优化，优化后的培养基为葡萄糖12.00 g/L、酵母粉18.00 g/L、Ca2+ 55.00 mmol/L、Mg2+ 60.00 mmol/L、L-谷氨酸钠26.00 g/L，优化后GABA产量达8.037 g/L，较优化前5.490 g/L提高150.00%。

发酵罐工艺优化将有助于提高GABA的产量。叶砚等[34]在响应面优化的基础上对工艺条件进行了优化，最优条件为34 ℃，pH 5.5，通风量120 L/h，GABA产量达9.180 g/L。杨帆[16]对E.coli AS1.505在发酵罐中进行培养并优化了培养条件：pH为7.0，搅拌转速600 r/min，通风量为1.5 m3/（m3·min），葡萄糖起始浓度为10.70 g/L，在培养2 h后以恒速流加葡萄糖至终浓度为30.83 g/L，菌体浓度在11 h达到最大值18.100 g/L，再加入88.20 g/L的L-谷氨酸转化16 h后得到60.00 g/L的GABA，其转化率达到100%。

4 展望

GABA作为一种重要的抑制性神经递质，其参与多种代谢活动，具有延缓大脑衰老、降血壓、降血氨、治疗神经疾病、抗心律失常等多种生理功能，其作为一种全新的活性因子广泛应用于医药和食品领域。随着人们对GABA认识的深入，对GABA的需求日益增长，开发食品安全级的GABA并降低生产成本已成为亟待解决的问题，GABA的工业化生产将有广阔的发展前景。

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