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生物法生产25—羟基维生素D3条件优化

2017-07-13付跃李连威张阳阳

安徽农业科学 2017年2期
关键词:骨化葡萄糖条件

付跃 李连威 张阳阳

摘要[目的]优化25-羟基维生素D3[25(OH)VD3]的转化条件,提高25(OH)VD3产量。[方法]通过单因素试验和正交试验对菌株UV-FY-141转化生产25(OH)VD3的条件进行优化。[结果]确定其最佳发酵培养基:葡萄糖15.00 g,蛋白胨20.00 g,NaCl 5.00 g,CaCO3 2.00 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,去离子水1 000 mL。优化后转化条件:发酵初始pH 6.5,发酵温度为28 ℃,发酵时摇床转速为200 r/min,发酵时间为72 h。在优化条件下,25(OH)VD3产量由原来的9.460 mg/L提高到13.130 mg/L,提高了38.79%。[结论]采用优化后的转化条件,可显著提高25(OH)VD3的产量。

关键词 25-羟基维生素D3;优化;发酵

中图分类号 R914.5 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2017)02-0007-04

Abstract[Objective] The aim was to optimize the conversion efficiency of 25(OH)VD3.[Method]We optimized fermentation conditions of strain UVFY141 by single factor and orthogonal experiment.[Result] The optimum fermentation conditions were determined as follows:glucose 15.00 g,peptone 20.00 g,NaCl 5.00 g,CaCO3 2.00 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,and deionized water 1 000 mL.Conversion conditions were determined as follows:initial pH 6.5,fermentation temperature 28 ℃,rotation speed 200 r/min,fermentation time 72 h.The production of 25(OH)VD3 was improved by 38.79%,from 9.460 mg/L to 13.130 mg/L.[Conclusion] The optimized conditions can improve the yield of 25(OH)VD3 significantly.

Key words 25(OH)VD3;Opitimization;Fermentation

维生素D3(VD3)在人体内是没有活性的,只有转化成有活性的代谢产物才能发挥作用。维生素D3的活性衍生物主要有骨化二醇、骨化三醇等。维生素D3首先在肝脏转化成骨化二醇,然后在肾脏中转化成骨化三醇[1],其中骨化二醇是血液中主要存在形式,骨化三醇是最有活性的代谢衍生物[2]。25-羟基维生素D3[25(OH)VD3],又称骨化二醇,是通过人体内的VD3羟化酶转化而来的[3-4],对光、空气、热敏感,不溶于水,易溶于乙醇等极性有机溶剂[5]。骨化二醇临床上用于治疗甲状腺功能衰退、骨质疏松、牛皮癣、慢性肾功能衰竭[1]。骨化二醇能够化学合成,但是步骤复杂,成本高,相对于化学合成,生物转化具有明显优势。研究表明,一些微生物能够将维生素D3转化成骨化二醇和骨化三醇,步骤简单,成本低[6]。生物转化速率不仅受微生物培养组分、培养过程的影响,而且受培养条件(pH、温度等)的影响[7] 。发酵条件的优化对生物转化生产VD3十分重要。笔者采用单因素试验和正交试验对生物法合成25(OH)VD3条件进行了优化,旨在为提高VD3的转化率提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌种。

放线菌UV-FY-141:广西大学生命科学与技术学院食品与发酵研究所保存。

1.1.2 试验药剂。维生素D3(分析纯)、25-羟基维生素D3(分析纯),美国Sigma公司;氯化钠(分析纯),天津博迪化工有限公司。

1.1.3 培养基。

斜面培养基:可溶性淀粉20.00 g,硝酸钾1.00 g,NaCl 0.50 g,磷酸氢二钾0.50 g,MgSO4·7H2O 0.50 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,去离子水1 000 mL。种子培养基:葡萄糖15.00 g,蛋白胨15.00 g,玉米浆干粉5.00 g,NaCl 5.00 g,CaCO3 2.00 g,去离子水1 000 mL,pH 7.0。发酵培养基:葡萄糖15.00 g,植物用大豆蛋白胨15.00 g,玉米浆干粉5.00 g,NaCl 5.00 g,CaCO3 2.00 g,去离子水1 000 mL,pH 7.0。

1.1.4 仪器。

EBA21型高速离心机,Hettich zentrifugen公司;YP1200型电子天平,上海精科实业有限公司;岛津10-AT高效液相色谱仪,日本岛津有限公司;UV1601紫外分光光度计,日本Shimadiu公司;依利特Hypersil C18 色谱柱(4.60 mm×250.00 mm,5 μm),美国热电公司。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化。

从-80 ℃冰箱中取出甘油保藏的菌种UV-FY-141,接种到装液量为50.00 mL的250.00 mL三角瓶中,28 ℃、180 r/min培养7~15 d;细菌活化好后梯度稀释,涂平板,在28 ℃生化培养箱中培养7 d;用接种环挑取单菌落,接种到斜面培养基;在28 ℃生化培养箱中培养7 d,-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 孢子溶液的制备。

从-20 ℃冰箱中取出斜面,灭菌15~20 min,用5.00 mL移液枪向斜面加灭菌去离子水10.00 mL,用接种环轻轻刮下孢子,用移液枪反复吹打后转移到装有玻璃珠的50.00 mL三角瓶中,28 ℃、180 r/min振荡30 min,打散孢子,然后4层纱布过滤,制备孢子悬液。

1.2.3 发酵。用移液枪吸取1.00 mL孢子悬液接种到种子培养基中,28 ℃、180 r/min培养48 h,吸取1.00 mL种子液接种到发酵培养基中,48 h后向发酵培养基中加入用无菌滤膜过滤的反应底物,相同条件下继续培养72 h。

1.2.4 发酵条件优化。

为了提高25(OH)VD3的产量,对发酵条件进行优化,主要优化碳源、氮源、无机盐离子、初始pH、温度和转速。控制其他条件不变,只改变其中1个条件逐步优化。优化完成后,选择对发酵影响显著的单因素进行正交试验,选择最优条件。

1.2.5 供试品的制备。

采用Bligh-Dyer法[8]制备供试品。发酵结束后取1.00 mL发酵液于离心管中,每个样品中加入3.75 mL氯仿和甲醇的混合溶液(1∶2,V/V),振荡混匀后再向其中加入1.25 mL氯仿溶液,振蕩混匀,此时会看到大量絮状沉淀,然后加入1.25 mL纯水,振荡混匀,此时会看到溶液分层;6 000 r/min离心5 min。取1.00 mL下层溶液于离心管中,旋转蒸发仪干燥。检测时用乙腈溶解,并用无菌滤膜过滤。

1.2.6 标准溶液的制备。

称25(OH)VD3标准品1 mg,溶解于10.00 mL无水乙醇中,配制成100 μg/mL母液。稀释母液为20、40、60、80、100 μg/mL梯度浓度标准液。

1.2.7 检测条件。

采用依利特Hypersil C18色谱柱(4.60 mm×250.00 mm,5 μm),流动相为乙腈-水(80∶20,V/V),流速为1 mL/min,柱温设为50 ℃,检测波长为265 nm。

2 结果与分析

2.1 碳源对25(OH)VD3产量的影响

碳源是一类能够提供碳素化合物的营养物质,能够为微生物新陈代谢提供生命活动所需的能量,提供细胞或合成产物的物质基础。选择可溶性淀粉、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖5种碳源按2%的添加量加入到培养基中进行单因素试验。由图1可知,以葡萄糖为碳源时,25(OH)VD3的产量最高,所以选择葡萄糖作为发酵过程中的碳源。

选择合适的碳源浓度进行试验。由图2可知,在一定浓度范围内25(OH)VD3 的产量随着葡萄糖浓度升高而升高,超过一定浓度后产量下降,当葡萄糖浓度为2%时25(OH)VD3产量最高,所以发酵浓度选择2%。

2.2 氮源对25(OH)VD3产量的影响

氮源也是微生物生长和合成产物的重要物质。选择酵母膏、蛋白胨、玉米浆干粉、KNO3、NH4Cl进行试验,添加量为2%。由图3可知,蛋白胨对发酵影响显著。因此,对蛋白胨的浓度进行优化。由图4可知,25(OH)VD3产量随蛋白胨浓度的增加先升高后降低,在蛋白胨浓度为3%时达到最大值。因此,发酵培养基中蛋白胨浓度选择3%。

2.3 无机盐离子对25(OH)VD3产量的影响

无机盐离子对微生物生长和产物合成也十分重要。它们或者是酶活性中心组成成分,或者参与维持大分子和细胞结构的稳定性,调节渗透压平衡,控制细胞的氧化还原电位,或者作为微生物生长的能源物质。微生物生产代谢所需要的无机盐一般包括磷酸盐、硫酸盐、氯化物及含有钠、钾、钙、镁、铁等金属元素的化合物。研究CaCO3、MeSO4·7H2O、NaCl、K2HPO4、CaCl2对25(OH)VD3产量的影响。由图5可知,NaCl、CaCO3对发酵影响显著。因此,对该2种无机盐离子的浓度进行研究。由图6可知,25(OH)VD3的产量随着CaCO3浓度的升高先升高后降低,当CaCO3浓度为0.2%时25(OH)VD3产量最高;当NaCl浓度为0.5%时25(OH)VD3产量最高。因此,2种无机盐离子及其浓度分别选择0.5%NaCl和0.2%CaCO3。

2.4 发酵培养基组分的正交试验结果

通过单因素试验发现,葡萄糖、蛋白胨和CaCO3的浓度对25(OH)VD3产量影响显著,因此,选择这3个单因素进行L9(34)正交试验,每组试验设3个平行(表1)。

由表2可知,在试验2的条件下,25(OH)VD3的产量最高,为11.130 mg/L,此时发酵培养基中营养成分的配比为葡萄糖1.50%、蛋白胨3.00%、CaCO3 0.20%。在上述条件下重复试验,试验结果与试验2结果基本一致,所以培养基的最佳配比为A1B2C2。极差值RA>RB>RC,所以3个因素对25(OH)VD3产量影响大小排序为葡萄糖、蛋白胨、CaCO3。

方差分析表明,FA>FB> F0.95(2,2)>FC,表明葡萄糖和蛋白胨对25(OH)VD3产量影响显著,CaCO3影响不显著。

2.5 初始pH对25(OH)VD3产量的影响

微生物生长需要适宜的环境,其中pH是一项重要的因素。pH能够改变蛋白质、核酸等生物大分子所带电荷,可引起细胞膜的电荷变化,改变微生物细胞吸收和利用营养物质的能力。不同微生物对pH的要求各不相同,因此,选择合适的pH对微生物发酵具有重要意义。研究初始pH 5、6、7、8、9对25(OH)VD3产量的影响,由图7可知,25(OH)VD3的产量随着初始pH的升高而先升高后降低,当pH为7时25(OH)VD3产量最高, 所以发酵时选择pH 7。

2.6 温度对25(OH)VD3产量的影响

溫度是微生物生长的重要因素之一,不仅可以影响酶活性,改变酶的反应速率,还能够影响细胞膜的流动性,改变物质的运输能力,从而影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌。研究发酵温度26、28、30、32、34 ℃对25(OH)VD3产量的影响,由图8可知,在一定温度范围内,25(OH)VD3的产量随温度的升高而升高,超过一定范围,随温度的升高而降低。温度对产物产量的影响主要通过影响酶的活性来实现,同时温度的高低还会影响细胞膜的通透性,当温度适合时细胞膜的通透性增强,可以使更多的反应底物通过细胞膜,当温度为28 ℃时25(OH)VD3的产量最高,确定发酵温度为28 ℃。

2.7 摇床转速对25(OH)VD3产量的影响

摇床转速与三角瓶中的溶氧量有直接关系,主要通过溶氧量来影响发酵,转速较慢时,发酵液中的溶氧量少,不利于细菌发酵,如果过快则对细菌损伤大,也不利于发酵。研究转速140、160、180、200、220 r/min对25(OH)VD3产量的影响,由图9可知,当摇床转速为200 r/min时,25(OH)VD3的产量最高。分析原因,当摇床转速为200 r/min时,摇瓶中的容氧量充足,机械碰撞对菌体的损伤相对较小,两者达到平衡,有利于产物的合成。因此,选择200 r/min为发酵时的摇床转速。

2.8 发酵时间对25(OH)VD3产量的影响

发酵时间对产物合成的影响也十分显著,因为随着发酵时间的延长,菌体的状态、培养基组分、pH等都会发生变化,因此,对发酵时间进行优化十分必要。加入底物后,每隔12 h测1次产量,记录12、24、36、48、60、72、84、96 h的产量。由图10可知,加入反应底物后,25(OH)VD3的产量开始升高,60 h后产量基本稳定,所以确定发酵时间为60 h,与原来发酵时间相比,发酵时间缩短了12 h。

2.9 转化条件正交试验结果

经过单因素试验发现,初始pH、发酵温度和摇床转速3个因素对25(OH)VD3的产量影响显著,因此,选择这3个单因素进行L9(34)正交试验,每组试验设3个平行(表3)。

由表4可知,在试验2的条件下,25(OH)VD3的产量最高,为13.130 mg/L左右,此时转化条件的3个因素为:pH 6.5,发酵温度为28 ℃,转速为200 r/min。在上述条件下重复试验,试验结果与试验2结果基本一致,所以培养基的最佳配比为A1B2C2。极差值RA>RB>RC,所以3个因素对25(OH)VD3产量影响大小排序为pH、发酵温度、摇床转速。

方差分析表明,FA >F0.95(2,2)>FB>FC。因此,pH对25(OH)VD3产量影响显著,温度和转速影响不显著。

3 结论

通过单因素试验和正交试验对发酵培养基和转化条件进行优化,确定发酵培养基的组成:葡萄糖15.00 g,蛋白胨20.00 g,NaCl 5.00 g,CaCO3 2.00 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,去离子水1 000 mL。优化后转化条件:发酵初始pH为6.5,发酵温度为28 ℃,摇床转速为200 r/min,发酵时间为72 h。优化后,25(OH)VD3产量由原来的9.46 mg/L提高到13.13 mg/L,提高了38.79%。

参考文献

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